香菇多糖的過氧化氫脫色工藝研究

陳 健,耿安靜,徐曉飛,2

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.南方李錦記有限公司,廣東廣州 510620)

香菇多糖的過氧化氫脫色工藝研究

陳 健1,耿安靜1,徐曉飛1,2

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640; 2.南方李錦記有限公司,廣東廣州 510620)

為了脫除香菇多糖液中的色素,以過氧化氫 (H2O2)為脫色劑,選擇脫色時(shí)間、脫色溫度、pH和過氧化氫的質(zhì)量百分比濃度等因素為實(shí)驗(yàn)因素,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以此為基礎(chǔ)進(jìn)行 4因素 3水平的正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,在脫色時(shí)間 3h、溫度 55℃、pH7和過氧化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 7%的脫色條件下,可以有效地去除香菇多糖液中的色素。過氧化氫脫色時(shí)間短,香菇多糖保留率高,脫色效果優(yōu)于樹脂。

香菇多糖,過氧化氫,脫色,分子量

香菇多糖(lentinan,LNT)是從傘菌科真菌香菇(lentinus edodes)的子實(shí)體中分離到的一種β-1, 3-葡聚糖,具有廣泛的藥理活性,如免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤[1-4]、抗衰老作用、提高免疫和刺激干擾素形成、對化學(xué)物質(zhì)所致肝損傷具有保護(hù)作用以及作為LAK細(xì)胞活性向上調(diào)節(jié)劑(LURA)等,已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本研究以過氧化氫為脫色劑,考察脫色時(shí)間、脫色溫度、pH和過氧化氫濃度等因素對多糖脫色效果的影響,還考察了過氧化氫的脫色過程對多糖分子量的影響,并比較了過氧化氫脫色和樹脂脫色效果,為多糖的分離純化和香菇的開發(fā)利用提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

香菇粗多糖液 由南方李錦記有限公司提供,實(shí)驗(yàn)室自制;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 Dextrans Standand系列Mp=4400、9900、21400、43500、1248000、196000、277000、401000、1285000Da Sigma公司;雙蒸水實(shí)驗(yàn)室自制;濃硫酸、重蒸苯酚、濃鹽酸、氯化鈉、無水乙醇、正丁醇、氯仿、H2O2、磷酸二氫鉀等 均為分析純。

JA2003N精密電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;AnkeTGL-16G高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DBS-100自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠;DE-310冷凍干燥器 德國威思公司; BT-200B數(shù)顯恒流泵;凝膠滲透色譜(GPC)系統(tǒng) 美國 waters公司,Waters1525 Binary HPLC Pump、Waters 717 plus Autosampler、Waters 2414 Refractive Index Detector;數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) Breeze(V3.3)GPC工作站。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫色樣品液的制備 香菇→水提噴霧干燥→得香菇多糖粉末→稱量→溶解→乙醇沉淀→sevag法除蛋白→得香菇粗多糖溶液→放置于 4℃的冰箱里備用

1.2.2 單因素脫色條件的確定 影響過氧化氫脫除多糖液色素的重要因素有脫色時(shí)間、脫色溫度、溶液pH和過氧化氫的濃度等因素。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確立因素水平表(表 1),每個(gè)處理各取 10mL粗多糖液,于恒溫水浴鍋中脫色,在 420nm處用可見分光光度計(jì)測定溶液色素的吸光度,以脫色率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),脫色率的計(jì)算公式為：

脫色率 =(脫色前的吸光度 -脫色后的吸光度)/脫色前的吸光度。

表1 因素水平表

1.2.3 過氧化氫脫色正交實(shí)驗(yàn) 在確定最佳單因素條件的基礎(chǔ)上,選擇 L9(34)表進(jìn)行 4因素 3水平的正交實(shí)驗(yàn),以確定脫色的最佳方案。以脫色率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),實(shí)驗(yàn)方案如表 2所示。

表2 正交因素水平表

1.2.4 樹脂脫色工藝 按照文獻(xiàn)[5]的方法對樹脂進(jìn)行預(yù)處理。取香菇粗多糖溶液,在 420nm測定其吸光度,用已處理的樹脂在 45℃的恒溫水浴中靜態(tài)吸附脫色 3h后,再測定其吸光度,計(jì)算脫色率。

1.2.5 香菇多糖的純化流程

1.2.5.1 過氧化氫脫色后的多糖純化流程 香菇粗多糖溶液→過氧化氫脫色→過DEAE纖維素柱 (水洗脫)→濃縮→冷凍干燥→GPC測定分子量

1.2.5.2 717陰離子交換樹脂脫色后的多糖純化流程 香菇粗多糖溶液→717陰離子交換樹脂脫色→過DEAE纖維素柱(水洗脫)→濃縮→冷凍干燥→GPC測定分子量

1.2.6 香菇多糖分子量分布的 GPC表征 按照文獻(xiàn)[6]的色譜條件和測定方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 時(shí)間對過氧化氫脫色的影響

用過氧化氫脫除多糖液色素時(shí),原糖液加入10%的 H2O2溶液,在 45℃水浴中脫色 0.5、1、3、6、9h,脫色時(shí)間對多糖液的脫色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 1所示。

圖1 時(shí)間對過氧化氫脫色的影響

由圖 1可以看出,隨著時(shí)間的延長,過氧化氫的脫色率逐漸增加,但到 3h以后,脫色率增加得很緩慢。從 0.5h到 3h,脫色率增加了 20.48%,但從 3h到6h,脫色率增加了 5.97%,從 6h到 9h,脫色率只增加了 4.22%。為此,選擇 3h為最佳的脫色時(shí)間。

2.2 過氧化氫濃度對脫色效果的影響

糖液加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的過氧化氫脫除多糖液色素,在 45℃的水浴中脫色 5h,其結(jié)果如圖 2所示。

圖2 過氧化氫濃度對脫色的影響

由圖 2可以看出,隨著過氧化氫濃度的增加,脫色率逐漸增加。當(dāng)濃度由1%提高到10%,脫色率提高 15.9%,由 10%提高到 15%,提高的幅度是 6.4%,由 15%提高到20%時(shí),脫色率僅提高 2.8%,可見,盡管隨著過氧化氫的濃度的增加,多糖的脫色率增加,但增加得很平緩,增加的速度很小。考慮到脫色率、成本和降解等因素,實(shí)際情況下取 10%作為最大濃度。

2.3 溫度對脫色效果的影響

用過氧化氫脫除多糖液色素時(shí),原糖液加入10%的過氧化氫溶液,采用 35、45、55、65、75℃等脫色溫度對多糖液的脫色 6h實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖 3所示。

圖 3 溫度對H2O2脫除多糖色素的影響

由圖 3可以看出,隨著溫度的升高,過氧化氫的脫色率逐漸增加,但當(dāng)溫度升高到 55℃時(shí),脫色率增長幅度開始變得很緩慢。當(dāng)溫度從35℃提高到55℃時(shí),脫色率提高 23.13%,從 55℃提高到 75℃,脫色率只提高 5.39%,考慮到香菇多糖在高溫條件下容易降解,選擇 55℃為脫色溫度。

2.4 pH對脫色效果的影響

加入 pH為 4、6、7、8、10的緩沖液于香菇多糖溶液中,再加入10%的過氧化氫溶液,在55℃恒溫水浴中脫色 6h,測定脫色前后的糖液的吸光度,計(jì)算脫色率,其結(jié)果如圖 4所示。

由圖 4可知,在酸性條件下,隨著 pH上升,脫色率開始時(shí)緩慢增加,而后迅速增加,當(dāng) pH接近 7時(shí),達(dá)到峰值,隨后下降?？紤]到酸性和強(qiáng)堿的條件下,多糖易降解,實(shí)際選擇的 pH條件在中性附近。

2.5 過氧化氫脫色正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

脫色時(shí)間、脫色溫度、pH和過氧化氫的加樣量等綜合因素對多糖液的脫色效果及極差分析結(jié)果見表3。

圖4 pH對過氧化氫脫色的影響

表 3 多因素影響過氧化氫脫除多糖液色素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表 3的極差分析可以看出,各因素對過氧化氫脫色影響順序?yàn)锳＞D＞B＞C,即時(shí)間為最重要因素,其次為 pH、加樣量和溫度。理論優(yōu)化方案為A3B1C1D3,即脫色溫度為 55℃、時(shí)間為 3h、pH為 7,過氧化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 7%,該條件下過氧化氫的脫色效率最高。

2.6 不同方法脫色所得的香菇多糖的比較

圖 5中L1和L2分別為由 717陰離子交換樹脂脫色工藝和過氧化氫脫色 (3h,7%,55℃,pH7)及后續(xù)純化后獲得的香菇多糖分子量 GPC圖。

圖 5 不同方法脫色對香菇多糖分子量的影響

可以表 4和圖 5可知,經(jīng) 717陰離子交換樹脂脫色后,所得的香菇多糖 L1的重均分子量 (Mw)是 28945Da,多分散性為 2.40,而經(jīng)過過氧化氫脫色后,所得的香菇多糖的重均分子量 (Mw)是 25967Da,多分散性分別 2.11。二者分子量和峰形狀均比較接近,表明經(jīng)優(yōu)化的過氧化氫脫色工藝對香菇多糖分子量影響不大,對香菇多糖的降解作用小。

表4 L1與L2的GPC分子量數(shù)據(jù)

表 5 樹脂與過氧化氫的脫色效果的比較

從表 5可知,用 717樹脂脫色,脫色率要比過氧化氫脫色方法高出 4.1%;但多糖的保留率要低24.3%。用過氧化氫脫色所得的香菇多糖外觀好,而且工藝簡單,多糖保留率高。

3 結(jié)論

綜上所述,為了探索用過氧化氫脫除香菇多糖色素的適宜條件,在脫色時(shí)間、脫色溫度、pH和過氧化氫的加樣量等單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)上述 4因素 3個(gè)水平的正交實(shí)驗(yàn)方案,實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)極差分析發(fā)現(xiàn),適宜的脫色條件是脫色時(shí)間 3h、脫色溫度55℃、pH7、過氧化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 7%。香菇多糖經(jīng)過氧化氫短時(shí)間脫色后,不僅脫色率高,而且分子量也沒有大的變化。通過比較樹脂和過氧化氫脫色的效果、工藝等,過氧化氫除了無麻煩的預(yù)處理和再生、環(huán)保、脫色率高以外,多糖的保留率高。因此,過氧化氫脫色比樹脂脫色更具有優(yōu)勢和廣闊的運(yùn)用前景。

[1]Chihara G,Maeda Y,Hamuro J,et al.Inhibition of mouse sarcom a 180 by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.) Sing[J].Nature,1969,222(5194)：687-688.

[2]Chihara G,Hamuro J,Maeda Y,et al.Fractionation and purification ofthe polysaccharides with marked antitumour activity,especially lentinan,from Lentinus edodes(Berk.)Sing [J].Cancer Research,1970,30：2776-2781.

[3]Takuma Sasaki,Nobuo Takasuka.Futher study of the structure of Lentinan,an Antitumor Polysaccharide from Lentinus edodes [J].Carbohydrate Research,1976,47(1)：99-104.

[4]袁靜 .香菇多糖的抗腫瘤作用[J].上海醫(yī)院藥學(xué),1999,10 (1)：29-32.

[5]王元鳳,金征宇 .茶多糖脫色的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2004,20(12)：60-65.

[6]金鑫,賴鳳英 .仙人掌多糖的提取、分離純化及 GPC法測定其分子量[J].現(xiàn)代食品科技,2006(2)：138-140,149.

Study on decolorizing technology of lentinan by hydrogen peroxide

CHEN Jian1,GENG An-j ing1,XU Xiao-fei1,2
(1.College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.NanfangLee Kum Kee Co.,Ltd.,Guangzhou 510620,China)

In orde r to decolorize the lentinan,hyd rogen p e roxide was used to be reagent for decolorizing it,and the t im e,temp e ra ture,pH as we ll as m ass frac tion of hyd rogen p e roxide we re se lec ted to be fac tors for the exp e r im ent of s ing le fac tor,then the orthogona l tes t w ith four fac tors and three leve ls was ca rried out on the aforem entioned bas is.The results showed tha t the p olysaccha ride was decolorized effec tive ly unde r the cond itions which the t im e was3h,the temp e ra ture was a t55℃,the pH was7and the m ass frac tion of hyd rogen p e roxide was7%.The decolora tion t im e by hyd rogen p e roxide was shorte r,and the re tention ra te of lentinan was highe r.In b rief,the decolora tion effec t by hyd rogen p e roxide was be tte r than by res in.

lentinan;hyd rogen p e roxide;decolorize;m olecula rwe ight

TS201.2

B

1002-0306(2010)03-0293-03

2009-03-25

陳健(1967-),男,博士,副教授,主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)、糖分析等方面的研究工作。