非洲山毛豆種子蛋白質組分分析

李小華,于 新,畢 陽 (.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070; 2.仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院,廣東廣州 50225)

非洲山毛豆種子蛋白質組分分析

李小華1,2,于 新2,＊,畢 陽1(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070; 2.仲愷農業(yè)工程學院輕工食品學院,廣東廣州 510225)

以山毛豆種子為原料,對其蛋白質進行分級分離,測定了各組分蛋白含量、等電點和溶解度。結果表明,脫脂山毛豆粉的總蛋白含量為 47.11%(m/m)。其中,清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的相對百分含量分別為 64.04%、8.83%、11.06%和 14.50%,另外含有 1.57%難溶的復合蛋白。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的等電點為 pH 4.3、pH5.1和pH 4.7,谷蛋白的等電點為 3.5～3.8。它們在等電點附近溶解度較小,偏離等電點之后即 pH＞5或 pH＜4清蛋白和球蛋白的溶解度增大,而醇溶蛋白和谷蛋白的溶解度增加較小。SDS-PAGE電泳表明,非洲山毛豆種子總蛋白的相對分子量差異較大,在 20.1～97.2kDa及小于 20.1kDa的均有分布,但其譜帶分布不明顯。清蛋白譜帶變化范圍為主要有 6條,變化區(qū)域集中在 20.1～66.4kDa及小于 20.1kDa的范圍。球蛋白在 20.1～66.4kDa大約出現了 10條譜帶。醇溶蛋白在 20.1、29.0、44.3kDa分別有3條明顯的譜帶。谷蛋白在 20.1～97.2kDa大約有 10條以上的譜帶,說明非洲山毛豆種子總蛋白及各組分蛋白均有不同的分子組成。

山毛豆種子,蛋白質組成,等電點,溶解性,SDS-PAGE電泳

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

非洲山毛豆種子 2008年 1月 20日采自廣州市花都區(qū)北興鎮(zhèn)山坡(北緯 23°27’,東經 113°26’),通過索氏抽提油脂得到山毛豆粕(粉末)。

電子天平 德國 Sartorial公司;島津 UV-2550紫外可見分光光度計 島津蘇州工廠;M ini-PROTEAN4電泳儀 美國B IO-RAD公司;TGL-16C型臺式離心機 上海安寧科學儀器廠;PHS-25型酸度計 上海偉業(yè)儀器廠;85-2型恒溫磁力攪拌器上海司樂儀器有限公司;G-9140A型電熱恒溫干燥箱 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;數顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠;SD-1500噴霧干燥機 上海沃迪科技有限公司;LGJ-12冷凍干燥機北京松源華興科技發(fā)展有限公司;凱氏定氮裝置。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙縮脲試劑的配制 將 10mol/L氫氧化鉀10mL和 25%酒石酸鉀鈉溶液 20mL加入到 930mL蒸餾水中,劇烈攪拌,同時慢慢加入 4%硫酸銅溶液40mL,以免生成氫氧化銅沉淀[7]。

1.2.2 蛋白質組分的分級分離 稱取一定量的脫脂山毛豆粉,置于燒杯中,按豆粉和水比例為 1∶10(m/v)加入去離子水,在室溫下強力攪拌 1h,離心,得到的上清液為清蛋白組分。向燒杯中的殘渣中加入 10% (m/m)的NaCl溶液(與上述去離子水等體積),室溫下攪拌 1h,離心,得到的上清液為球蛋白組分。向上述鹽溶液提取后的殘留物中加 75%乙醇(與上述去離子水等體積),用玻棒攪拌,將混合液置于 80℃的水浴中 5min,在此期間不停攪拌。其后取出燒杯,繼續(xù)攪拌 5min,離心 (4000r/min,10min),收集上清液,即為谷蛋白組分。向上述乙醇溶液提取后的殘留物中加入 0.2%的 NaOH溶液 (與上述去離子水等體積),攪拌 15min,離心 (4000r/min,10min),收集上清液,作為谷蛋白待測分析[8]。

1.2.3 山毛豆清蛋白和球蛋白的制備

1.2.3.1 清蛋白制備 清蛋白提取液經噴霧干燥得粉狀清蛋白制備物。

1.2.3.2 球蛋白制備 球蛋白提取液經蒸餾水透析72h后,離心收集沉淀,凍干備用。

1.2.3.3 球蛋白和醇溶蛋白的制備 各組分提取液對蒸餾水透析 72h后,離心收集沉淀,凍干備用。

1.2.3.4 谷蛋白組分的制備 谷蛋白提取液用2mol/L HCl調 pH至 4.5,離心收集沉淀,水洗 3次,凍干備用。

1.2.4 蛋白質含量的測定 微量凱氏定氮法[7]。

1.2.5 等電點測定

1.2.5.1 等電點范圍的預實驗 稱取 5.00g組分蛋白溶于 500mL去離子水,得到 1.00%樣品提取液,分別取 1%樣品提取液 10mL于 5支標有管號和管種的20mL離心管中,分別依次調 pH為 2、3、4、5、6,然后在離心機上以 3000r/min離心 15min后,小心倒去清液,烘干一定程度,稱其沉淀質量。

1.2.5.2 雙縮脲法測等電點 將各組分蛋白分別用去離子水配制成 0.5%、1%和 2%的樣品液。分別取樣品液 10mL于 50mL比色管中,分別依次調 pH為等電點周圍 7～9個點,然后在離心機上以 3000r/min離心 15min后,小心收集上清液,用雙縮脲法測吸光度值。分別依次取 10mL上清液于對應號數的 25mL容量瓶,加 0.5mL四氯化碳,用雙縮脲試劑定容至刻度。靜置 1h后,取上清液 12mL離心,取離心分離后透明液于比色皿中,在 560nm下測定吸光值[9]。

1.2.6 溶解性實驗[5]樣品的溶解性用氮溶解指數(NSI)來評價。分別用去離子水配制 1%(m/v)蛋白樣品溶液 8mL,用 0.05mol/L HCl或 0.05mol/L NaOH溶液調 pH至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,磁力攪拌120min,離心 15min,采用凱氏定氮法測定上清液中的蛋白含量。

1.2.7 SDS-PAGE電泳分析 參照 Lemion的方法[10]進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠濃度為10.0%,濃縮膠濃度 4%,每管點樣 20μL,在 15mA恒壓電泳 45min,用考馬斯亮藍染色 30min,用脫色液脫色至背景無色,拍照保留。標準分子量購于寶生物工程有限公司。

2 結果與分析

2.1 山毛豆蛋白質組分測定

根據蛋白質在不同溶劑中溶解度不同的性質,可以將山毛豆種子蛋白質分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。測定不同蛋白組分,了解山毛豆種子蛋白的基本組成,表 1表示山毛豆種子各組分蛋白的含量。

表 1 各組分蛋白在山毛豆種子中的分布

表 1表明,山毛豆種子的清蛋白含量最高,占山毛豆種子總蛋白的 64.04%,為組成山毛豆種子蛋白的主要成分。另外含有球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,分別占總蛋白的 8.83%,11.06%和 14.50%左右,以及少量難溶的復合蛋白(1.57%)。

2.2 等電點測定結果

2.2.1 等電點預實驗結果 沉淀結果表明,山毛豆清蛋白的最佳沉淀結果應在 pH4～5,球蛋白最佳沉淀結果在 pH5左右。醇溶蛋白較優(yōu)沉淀結果在 pH5左右,谷蛋白較優(yōu)沉淀結果為 pH3～4左右。

2.2.2 雙縮脲法測定 為了較準確地測出山毛豆組分蛋白的等電點,根據植物性蛋白質等電點大部分呈酸性特點,以 2.2.1的結果為依據,分別設定不同pH間隔,利用雙縮脲法準確測定其等電點,結果如圖1～圖 4所示。

圖1 清蛋白在不同 pH下離心液吸光度

圖2 球蛋白在不同 pH下離心液吸光度

圖 3 醇溶蛋白在不同pH下離心液吸光度

圖4 谷蛋白在不同 pH下離心液吸光度

本實驗得到的山毛豆清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白離心液的吸光度隨 pH變化的趨勢明顯不同;而同種蛋白的不同濃度的的吸光度隨 pH變化的趨勢相同,而且隨著蛋白濃度的增加,離心液的吸光度明顯增大。清蛋白離心液的吸光度變化基本呈“U”型,球蛋白的變化呈“V”型,醇溶蛋白離心液的吸光度變化基本呈“√”型,谷蛋白離心液的吸光度變化基本呈反的“√”型。由圖 1可知,清蛋白離心液吸光值最小在pH4.3,這可能是由于在此pH下,蛋白質多肽鍵之間的靜電推斥作用受到抑制,以及蛋白質間的相互作用超過了蛋白質與溶劑間的相互作用而引起了聚集反應,破壞了蛋白質的空間結構,使蛋白質溶解度最低[14]。利用雙縮脲法所測吸光值與蛋白質量成正比的關系,可知在 pH為 4.3時離心液中蛋白質含量最少,即在 pH4.3時清蛋白沉淀量最大,因此可確定山毛豆清蛋白等電點為 pH4.3。同理可確定山毛豆球蛋白、醇溶蛋白等電點分別為pH5.1,pH4.7,谷蛋白的等電點為 3.5～3.8。

2.3 溶解性

植物蛋白的溶解性是蛋白質最重要的一個功能性質,蛋白質的其它功能性質如乳化性、起泡性、凝膠性等都與其溶解性有關。蛋白質的溶解性受加工條件的影響很大,特別是 pH,在不同的 pH下,其溶解度有較大的差異。實驗表明,山毛豆種子的清蛋白和球蛋白分別在 pH4和 pH5附近溶解度均較小, pH＞4時,清蛋白的溶解度隨 pH的增大而增大,在當pH4～5之間時,球蛋白的溶解度較小,pH＜4或 ＞5時,球蛋白的溶解都比較大,其中清蛋白的 pH-NSI曲線形狀跟大豆蛋白相類似[11]。在實驗 pH范圍內,醇溶蛋白和谷蛋白其溶解度都比較小 (NSI＜30%),其中醇溶蛋白在 pH5時溶解度最小,而谷蛋白在pH4溶解度較小 (圖 5),這和 2.2測得的組分蛋白的等電點是一致的,即山毛豆組分蛋白的溶解度在等電點附近最低,離開等電點之后隨著堿量的增加(增大 pH)和酸量的增加 (減小 pH)其溶解度增強。原因是在等電點附近蛋白質多肽鏈之間的靜電推斥作用受到抑制,以及蛋白質間的相互作用超過蛋白質與溶劑間的相互作用引起聚集反應,從而破壞了蛋白質的空間結構。蛋白質分子電荷密度及疏水性是影響蛋白質溶解度的主要因素,較高的電荷密度和較低的疏水性才能有較高的溶解度[12]。

圖5 山毛豆中各組分蛋白的pH-NSI曲線

2.4 SDS-PAGE電泳

由圖 6可知,非洲山毛豆種子總蛋白的相對分子量差異較大,在 20.1～97.2kDa及小于20.1kDa的均有分布,但其譜帶分布不明顯,說明其總蛋白的組成相對較復雜。清蛋白譜帶變化范圍為主要有 6條,變化區(qū)域集中在 20.1～66.4kDa及小于 20.1kDa的范圍,說明山毛豆清蛋白主要由低分子量亞基構成。球蛋白在 20.1～66.4kDa大約出現了 10條譜帶,說明了球蛋白組成的不均一性。醇溶蛋白在 20.1、29.0、44.3kDa分別有 3條明顯的譜帶,其中 29.0kDa的譜帶顏色最深,說明醇溶蛋白中此分子量的亞基含量最高,和前兩種蛋白比較,其組成相對較簡單,而且其相對分子量較小。谷蛋白在 20.1～97.2kDa大約有10條以上的譜帶,其組成也相對比較復雜。在山毛豆種子的分離提取中,采用連續(xù)提取法。由于清蛋白水溶性蛋白且含量高,所以采用直接提取法或提取清蛋白后依次提取其他蛋白。則各組分的譜帶都具有相似性。實驗發(fā)現,經 3～4次重復提取后球蛋白已不含清蛋白譜帶。

圖 6 山毛豆總蛋白及各蛋白組分的 SDS-PAGE圖譜注：1-標準蛋白,2-總蛋白,3-清蛋白, 4-球蛋白,5-醇溶蛋白,6-谷蛋白

3 結論

非洲山毛豆種子蛋白質主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等組成。其中,清蛋白含量最高,占總蛋白的 64.04%(m/m),球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的相對百分含量分別為 8.83%(m/m),11.06% (m/m)和 14.50%(m/m)。另外,有少量難溶的復合蛋白,其相對含量為 1.57%(m/m)。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的等電點為 4.3、5.1和 4.7,谷蛋白的等電點為 3.5～3.8。清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別在其等電點附近溶解度最小,偏離等電點時清蛋白和球蛋白的溶解度較大,而醇溶蛋白和谷蛋白的溶解度較小。SDS-PAGE電泳表明了非洲山毛豆種子蛋白及各組分蛋白具有不同的分子組成。非洲山毛豆種子總蛋白的相對分子量差異較大,在20.1～97.2kDa及小于 20.1kDa的均有分布,但其譜帶分布不明顯。清蛋白譜帶變化范圍為主要有 6條,變化區(qū)域集中在 20.1～66.4kDa及小于 20.1kDa的范圍。球蛋白在 20.1～66.4kDa大約出現了 10條譜帶。醇溶蛋白在 20.1、29.0、44.3kDa分別有 3條明顯的譜帶。谷蛋白在 20.1～97.2kDa大約有 10條以上的譜帶。

和大豆 (蛋白含量 38%)[13]、花生 (蛋白含量22%～26%)[13]等蛋白含量較高的蛋白質資源比較,山毛豆的蛋白含量較高(38.73%)。非洲山毛豆主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等組成,清蛋白是其主要成分。而大豆主要由清蛋白 (5%)和球蛋白(95%)組成。其中球蛋白是主要成分。花生蛋白大約 10%是水溶性的,其余 90%為花生球蛋白(63%)和伴花生球蛋白 (33%)[13]。和花生、大豆相比較,非洲山毛豆的水溶性蛋白含量最高。而蛋白質的溶解度影響其功能性質,其中最受影響是增稠、起泡、乳化和膠凝作用,不溶性蛋白質在食品中的應用是非常有限的[14],所以非洲山毛豆種子蛋白質在食品中有廣泛應用的潛質。

[1]鄧輔唐,喻正富,楊自全,等 .山毛豆、木豆、豬屎豆在高速公路邊坡生態(tài)恢復工程中的應用 [J].中國水土保持,2006 (4)：21-24.

[2]Gachene CKK,Wortmann CS.Green manure/cover crop technology in eastern and central uganda：development and dissemination[M].SpringerNetherlands,2004：219-236.

[3]Kwesiga F,Akinnifesi FK,Mafongoya P L,et al.Agroforestry research and development in southern Africa during the 1990s：Review and challenges ahead[J].Agroforestry Systems,2003,59 (3)：173-186.

[4]李小華,李永勝,曾曉房,等 .山毛豆資源的研究與利用[J].仲愷農業(yè)技術學院學報,2008,21(4)：31-35.

[5]MANSON A.The action of certain assamese plant as larvicides [J].Journal of theMalaria Institute of India,1939,2(1)：85-93.

[6]于新,嚴卓勤,李小華,等 .非洲山毛豆種子的物理特征、成分分析與油脂組成的研究 [J].中山大學學報,2009(1)：22-26.

[7]大連輕工業(yè)學院,華南理工大學,鄭州輕工業(yè)學院,等 .食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2006：224-225.

[8]劉擁海,俞樂,肖迪 .蕎麥種子蛋白質組分分析[J].種子, 2006,25(12)：31-33.

[9]施樹 .兩種胡麻餅粕提取蛋白質等電點測定[J].糧食與油脂,2007(8)：25-26.

[10]郭堯君 .蛋白質電泳技術 [M].北京：科學出版社,2005：85-l00.

[11]李安林,熊雙麗,韓珍瓊 .豇豆籽蛋白的功能性質分析[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(2)：741-742.

[12]Pearce KN,Kinsella JE.Emulsifying properties of proteins：evaluation of a turbid imetric technique[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1978,26(3)：716-723.

[13]管斌,林洪,王廣策,等 .食品蛋白質化學[M].北京：化學工業(yè)出版社,2005.

[14]王璋,許時嬰,江波,等譯 .食品化學[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2003.

Analysis of contents of protein groups in Tephrosia vogeliiHook f.seeds

L I Xiao-hua1,2,YU Xin2,＊,BIYang1
(1.College of Food Science and Engineering,Gansu AgriculturalUniversity,Lanzhou 730070,China; 2.College ofLight Industry and Food Science,ZhongkaiUniversity ofAgriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

Taking Tep hros ia voge liiHook f.seeds as raw m a te ria ls,p rote ins from seeds we re g raded and sep a ra ted, the content and isoe lec tric p oint and solub ility of seeds p rote in g roup s we re de te rm ined.The results showed tha t tota l p rote in content of defa tted seeds p owde rwas47.11%(m/m),the re la tive p e rcentage content of a lbum in was 64.04%,tha t of g lobulin,g liad in,and g lute lin was8.83%,11.06% and14.50%,resp ec tive ly,defa tted Tep hros ia voge liiHook f.seeds p owde r a lso conta ined a sm a ll quantity of comp ound p rote in(1.57%)which was d ifficult to d issolve.In add ition,isoe lec tric p oint of each seed p rote in g roup was d iffe rent,isoe lec tric p oint of a lbum in was pH 4.3,g lobulin pH5.1,g liad in pH4.7,g lute lin pH3.5～3.8,and the ir the solub ility was the wors t a t nea r isoe lec tric p oint. Solub ility of a lbum in and g lobulin we re be tte r but tha t of g liad in and g lute lin we re worse a t pH＞5or pH＜4. SDS-PAGE showed tha t the re was g rea t d iffe rence in the re la tive m olecula rwe ight of tota lp rote in from Tep hros ia voge liiHook f.seeds,its sp ec trum band was not d is tinc t but d is tributed in20.1～97.2kDa and less than20.1kDa.S ix sp ec trum bands of a lbum in concentra ted a t the range of20.1～66.4kDa and less than20.1kDa.tota lp rote in and the four solub ility frac tions had d iffe rent p olyp ep tide comp os itions.The re we re10sp ec trum bands a t the range of 20.1～66.4kDa for g lobulin.And three d is tinc t sp c trum bands a t20.1,29.0,44.3kDa for g liad in,resp ec tive ly.M ore than 10bands we re d is tributed from 20.1kDa to97.2kDa.Hence,tha t tota l p rote in and the four solub ility frac tions had d iffe rent p olyp ep tide comp os itions

defa tted Tep hros ia voge liiHook f.seeds;p rote in comp os ition;isoe lec tric p oint;solub ility;SDS-PAGE

TS201.2+1

A

1002-0306(2010)03-0158-04

非洲山毛豆 (Tephrosia vogeliiHook f.)又稱福氏灰毛豆、窩氏灰葉,屬豆科,蝶形花亞科,灰葉屬,多年生灌木。作為一種優(yōu)良的水土保持、護坡綠化、土壤改良植物[1-4],其原產于非洲,主要分布在北緯 15°至南緯 20°的廣大地區(qū),亞洲也有自然分布[5]。近 10多年來,我國廣東、廣西、海南、云南、貴州、四川、福建等省區(qū)大量種植。非洲山毛豆種子產量高,不需要人工水、肥管理,未發(fā)現病蟲害,不需要使用農藥,荒山種植,不占用耕地。目前,尚未見中外文獻關于非洲山毛豆種子食用、飼用及營養(yǎng)價值的研究報道。我們前期研究結果表明,非洲山毛豆種子中粗蛋白含量為 38.73%(m/m)[6],說明其蛋白含量較高。本實驗進一步對非洲山毛豆種子蛋白進行了分級分離,測定了組分蛋白的等電點和溶解度,并對其進行SDS-PAGE電泳分析,確定出各組分蛋白的分子量范圍,以期為非洲山毛豆作為新的蛋白質資源開發(fā)利用提供部分理論依據。

2009-02-02 ＊通訊聯(lián)系人

李小華(1978-),女,在讀碩士研究生。

廣東省科技計劃資助項目(2008B030302001)。