副溶血性弧菌溫度-PH雙因素預警模型的建立

李 濤,寧喜斌,安秀華,符姜燕

(上海海洋大學,上海 201306)

副溶血性弧菌溫度-PH雙因素預警模型的建立

李 濤,寧喜斌＊,安秀華,符姜燕

(上海海洋大學,上海 201306)

以副溶血性弧菌Vp BJ1.1997為研究對象,采用均勻設計實驗方法,建立并驗證了溫度范圍為 7～43℃,pH范圍為 5.5～10.0的生長動力學模型。結果表明,所選一級模型的擬合效果優(yōu)劣依次為 Logistic方程 ＞Gompertz方程 ＞Linear方程,以Logistic方程為一級模型計算生長參數(shù);二級模型采用平方根模型進行擬合,得到模型相關系數(shù) r為0.9739,最低生長溫度為 11.7769℃,最低生長 pH為 7.38,經(jīng) F檢驗和偏差因子、準確因子驗證,模型可接受。

副溶血性弧菌,雙因素預測模型,均勻設計

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌Vp BJ1.1997 購于中國科學院普通微生物菌種保藏管理中心;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 上海市疾病預防控制中心;TCBS培養(yǎng)基 上?？禎櫳锟萍加邢薰尽?/p>

低溫生化培養(yǎng)箱 LRH-250CL(溫度波動 ± 1.0℃) 上海一恒科學儀器有限公司;臺式酸度計InoLab pH730 德國WT W儀器。

1.2 菌種活化

挑取 24h斜面培養(yǎng)的 Vp BJ1.1997一環(huán),接種于10mL TSB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng) 12h,備用。

1.3 菌體生長的測定

取制備好的菌懸液0.1mL接種于裝有 10mL TSB液體培養(yǎng)基的試管中 (接種量為 103～105cfu/mL),將試管按設計的條件培養(yǎng),每隔 1h取樣測定,采用平板計數(shù)法計數(shù)。每組培養(yǎng)條件平行 2次。

1.4 實驗方案設計

1.4.1 均勻?qū)嶒炘O計因素水平表的選擇 本實驗溫度范圍為7～43℃,pH為5.5～10.0,因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表

1.4.2 均勻設計實驗安排 采用 10因素 11水平的U11(1110)均勻設計表。根據(jù)均勻設計表的使用,2因素的U11(1110)均勻設計表選第 1、7列,其他列和第11行為空。

1.5 生長動力學模型的建立

1.5.1 一級模型 選定Linear方程、Gompertz模型及Logistic模型對實驗數(shù)據(jù)進行擬合,三種模型生物學意義表達式如表 2[6]。

表2 三種模型生物學意義表達式

式中,N：微生物在時間 t時的生物量;N0：t=0時的初始菌數(shù);A：t=+∞時的 lgN/N0,即當 N達到最大時所對應的值;U：生長速率;M：達到最大相對速率需要的時間。相關生長參數(shù)計算如下：

最大比生長速率

模型之間擬合效果的差異可通過比較相關系數(shù)r和殘差平方和(RSS)來獲知。r越接近于 1,RSS越小,說明模型的擬合效果越好。

1.5.2 二級模型 二級模型選用平方根模型,數(shù)學描述如下[7]：

為避免當溫度 T小于 Tmin或 pH小于 pHmin時,U為負值的情況,對模型修改如下：

式中,μmax是最大比生長速率;Tmin是最低生長溫度;α為系數(shù)。

1.5.3 模型驗證 應用偏差因子 (bias factor)和準確因子 (accuracy factor)對模型預測效果進行驗證和評價,計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 不同溫度-pH條件下Vp生長曲線的測定

根據(jù)VpBJ1.1997在不同溫度-pH組合條件下的生長數(shù)據(jù),繪制 Vp在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線,并據(jù)生長趨勢不同區(qū)分為圖 1(A)和圖 1(B)。

圖 1 VpBJ1.1997不同組合培養(yǎng)條件下的生長曲線

從圖 1(A)看出,在圖中設定條件下培養(yǎng) Vp呈正增長。溫度-pH組合為 39-9.0時增長幅度最快,其次為 27-9.5,19-8.0、31-7.5和 15-10.0增長趨勢較為緩和。此組條件比較發(fā)現(xiàn),組合中溫度均高于15,pH均高于 7.5。

從圖 1(B)看出,在圖中在設定條件下培養(yǎng) Vp呈負增長。溫度-pH組合為 35-5.5時下降幅度最大,其次為 43-7.0,再次為 23-6.0,11-6.5時下降幅度最小,下降趨勢最為緩和。此組條件比較發(fā)現(xiàn),除7-8.5組合條件外,其余各組合 pH均低于 7.0,而 7-8.5組合中溫度值較Vp生長溫度偏低。

2.2 一級模型的擬合

Linear方程多用于微生物在低溫條件下生長曲線的擬合,Gompertz方程、Logistic方程為 S形曲線函數(shù)方程,在微生物生長動力學研究中較為常用。運用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),對各條件下Vp的生長曲線進行回歸,得到部分統(tǒng)計分析結果,如表 3。

三種方程的擬合效果進行比較,10組實驗數(shù)據(jù)全部通過 Logistic方程擬合所得的 r值最高,對應的RSS值最小;其次為 Gompertz方程擬合所得的 r值較高,對應的 RSS值較小;而通過 Linear方程擬合所得的 r值均在同組比較中最低,對應的RSS值最大。由此得出,Logistic方程在本實驗中擬合效果優(yōu)于Gompertz方程,為最好;Linear方程的擬合效果最差。對 Logistic方程擬合結果進一步做統(tǒng)計學驗證并計算μmax,如表 4。

表 4 Logistic方程統(tǒng)計學驗證及μmax計算結果表

表6 模型回歸系數(shù)統(tǒng)計分析結果

從表 4中可看出,在顯著性差異分析中,10組數(shù)據(jù)的 F值均大于 F0.01(2,10),即 P＜0.01,因此在α= 0.01水平上差異極顯著,說明模型回歸效果較好;計算得Bf最小值為 0.9910,最大值為 1.0014,均接近 1,說明模型預測效果較好;Af最小值為 1.0145,最大值為 1.0871,均接近 1,說明預測值與實測值的平均誤差合理,模型可以接受。因此選定Logistic方程作為一級生長模型,進而計算μmax,得比生長速率最大培養(yǎng)條件組合為 39-9.0,μmax可達 1.9740h-1,生長速率最小組合為 35-5.5,μmax為-2.6340h-1,與圖 1直接觀察結果相符。

2.3 二級模型的擬合

據(jù)表 4中計算所得的生長速率,用平方根模型(2)進行擬合,建立二級模型。所得模型為：

μmax=0.18252＊ (T-11.7769)2＊ (logpH-0.8670)

模型相關系數(shù) r=0.9739,其中α=0.1825,Tmin= 11.7769,logpHmin=0.8607,即 pH=7.3773。由模型表達式中得出,實驗組 1、2、5、8、10為負值,其余為正值,與實測結果相符。值得注意的是,微生物在極限生長條件的生長速率難以準確測定,因此模型預測的最低生長溫度可能不是該菌的實際最低生長溫度?？捎^測的 Tmin值與 pHmin因選用不同菌株或使用不同培養(yǎng)基而有差異,但預測的 Tmin值與 pHmin是微生物的固有屬性,不隨培養(yǎng)基變化而變化[8]。二級模型的部分統(tǒng)計分析結果如表 5所示。

表5 模型統(tǒng)計分析結果

模型總體的顯著性可以通過 F統(tǒng)計量進行假設實驗。從模型的統(tǒng)計分析結果來看,模型 F＞F0.01(2,7),即 P＜0.01,因此在α=0.01水平上差異極顯著,說明模型整體回歸效果較好。對模型回歸系數(shù)進行統(tǒng)計分析,如表 6所示。

從表中可看出,Tmin的 t值均大于 t0.05(7),回歸系數(shù)達到顯著水平;pH的 t值大于 t0.01(7),回歸系數(shù)達到極顯著水平,其對應最低生長 pH的 95%置信區(qū)間為 7.3773±1.0347。利用函數(shù)繪制平臺 1.2版繪制模型三維曲面擬合圖,如圖 2所示。

圖2 模型擬合圖

2.4 模型驗證

以 TSB培養(yǎng)基為基質(zhì),將Vp在任意 5組組合培養(yǎng)條件下培養(yǎng),生長速率實測值和預測值進行比較分析,結果如表 7所示。

表7 培養(yǎng)基數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學驗證

利用Bf和Af對模型進行驗證,Bf為 0.8034(n= 5),Af為 1.5958(n=5)。Bf小于 1表明生長速率預測值比實測值大,一般認為 Bf在 0.75～1.25之間,模型即可接受;Af等于 1表明預測值與實測值完全吻合,一般在 1.1～1.9之間均可接受[9]。該模型Bf和Af值均在合理范圍內(nèi),說明模型可接受。

3 結論與討論

3.1 利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對不同溫度-pH條件下 VpBJ1.1997的實驗數(shù)據(jù)進行擬合,結果表明, Logistic模型比 Gompertz模型及線性模型能更好地擬合副溶血性弧菌的生長,在α=0.01水平上模型極顯著。擬合結果表明,培養(yǎng)溫度-pH組合為 39-9.0時,Vp比生長速率最大,組合為 35-5.5時,Vp比生長速率最小。

3.2 利用平方根模型對Vp進行最大比生長速率與溫度-pH之間關系的擬合,得到Vp生長的二級雙因素模型。預測得知,Vp的最低生長溫度為11.7769℃,最低生長 pH為 7.3773。F檢驗表明模型在α=0.01顯著,培養(yǎng)基數(shù)據(jù)Bf和Af驗證值在可接受范圍內(nèi),回歸系數(shù)分析表明回歸系數(shù)顯著,說明此模型能較好描述Vp比生長速率與溫度-pH之間的對應關系。

3.3 均勻設計由數(shù)學家方開泰和王元 1978年創(chuàng)立,與傳統(tǒng)“正交設計”相比,均勻設計將實驗點在高維空間內(nèi)充分均勻分散,使數(shù)據(jù)具有更好的代表性,為揭示規(guī)律創(chuàng)造必要條件。均勻設計在多水平實驗研究中有重要意義,在實驗點均勻分散的同時可大大減少工作量,縮短實驗周期,在醫(yī)藥、化工、食品及生物工程等領域都有應用。本文嘗試將均勻設計方法引入到微生物生長預測模型的建立過程中,并得到較好的實驗效果。但在微生物生長動力學研究中,大量數(shù)據(jù)的積累十分重要,均勻設計雖在水平數(shù)不變的條件下可減少實驗次數(shù),其精準性應進一步進行驗證比對。

[1]劉秀梅,陳艷,等 .1992～2001年食源性疾病暴發(fā)資料分析——國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)[J].衛(wèi)生研究,2004,33(6)：725-727.

[2]俞鶯,寧喜斌 .對蝦副溶血性弧菌的風險評估[J].現(xiàn)代食品科技,2006,23(5)：184-186.

[3]陳瑞英,魯建章,蘇意誠,等 .食品中副溶血性弧菌的危害分析、檢測與預防控制[J].食品科學,2007,28(1)：341-346.

[4]王璐華,寧喜斌 .副溶血性弧菌生長預測模型的建立與應用探討[J].華北農(nóng)學報,2008,23(增刊)：263-267.

[5]楊振泉,焦新安 .副溶血性弧菌在低溫貯藏過程中的失活動力學特征[J].食品科學,2008,29(7)：47-51.

[6]RatkowskyDA著,洪再吉等譯 .非線性回歸模型統(tǒng)一的實用方法[M].南京：南京大學出版社,1986：71-81.

[7]Adams M R,Little C L,Easter M C.Modeling the effect of pH,acidulant and temperature on the growth rate of yersinia enterocolitica[J].J ApplBacteriol,1991,71：65-71.

[8]MilesDW,Ross T,Olley J,et al.Development and evaluation of a predictive model for the effect of temperature and water activity on the growth rate of Vibrio parahaemolyticus[J].Food Microbiol,1997,38：133-142.

[9]Braun P,Sutherland JP.Predictive modeling of growth and enzyme production and activity by a cocktail of Pseudomonas spp., Shewanella putrefaciens andAcinetobacter sp[J].FoodMicrobiol, 2003,86：271-282.

Developm ent of predictive model for com bined effect of temperature and pH on the grow th ofVibrio parahaemolyticus

L I Tao,NING Xin-b in＊,AN Xiu-hua,FU Jiang-yan
(College of Food Science,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

Based on the s tanda rd s tra in-Vib rio p a rahaem olyticus BJ1.1997,its g row th s ta tus which affec ted by temp e ra ture(7～43℃)and pH(5.5～10.0)was s tud ied w ith uniform des ign.Theresults showed tha t Log is tic equa tion was op t im a l in p r im a ry m ode ls,while Gomp e rtz equa tion was m ore adap tab le than Linea r,so g row th p a ram e te rs we re ca lcula ted from Log is tic equa tion.The seconda ry m ode lwas deve lop ed by squa re rootm ode ls.Its rva lue was0.9739,the lowes t g row th temp e ra ture was11.7769℃and the lowes t g row th pH was7.38.Through F tes t and eva lua tion by b ias fac tor and accuracy fac tor,the m ode l can exac tly desc ribe the re la tionship be tween the g row th ra te and com b ined effec t of temp e ra ture and pH.

Vib rio p a rahaem olyticus;doub le-fac tors p red ic tive m ode l;uniform des ign

TS201.3

A

1002-0306(2010)03-0091-04

副溶血性弧菌 (V ibrio parahaem olyticus,簡稱Vp)又稱嗜鹽菌,廣泛分布于海灣、海岸線區(qū)域、鹽湖及海產(chǎn)品中,溫熱地帶較多,是沿海地區(qū)引起微生物性食物中毒的重要病原菌。國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示,沿海省份副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位[1]。該菌在水產(chǎn)品中的天然帶菌率較高,溫暖季節(jié)在海蝦中可高達90%[2],生長繁殖達一定量可引發(fā)人體病變,因此研究副溶血性弧菌在水產(chǎn)品中的生長動力學狀況,建立預警機制,對于保證水產(chǎn)品安全性具有重要意義。影響副溶血性弧菌生長的因素很多,如溫度、鹽度、pH等。副溶血性弧菌在含鹽 0.5%～8%的環(huán)境中生長,含鹽量為 2%～4%生長最佳,無鹽或高鹽 (10%)不生長;在溫度為 5～44℃范圍內(nèi)生長,以 30～35℃為最佳;適宜生長的 pH為 7.5～8.5,以 pH7.7為最佳, pH低于 6則生長不佳[3]。目前國內(nèi)學者多進行單因素生長動力學研究,并主要以溫度為對象,已建立了副溶血性弧菌的溫度預測模型以及低溫失活模型等[4-5],多因素協(xié)同作用模型的建立方法報道較少。本研究以溫度-pH交互作用為對象進行研究,鑒于副溶血性弧菌所涉及單因素生存范圍較寬、研究二因素交互作用時所取水平數(shù)較多而采用均勻設計,對副溶血性弧菌二級雙因素模型的建立方法進行初步探討。

2009-04-22 ＊通訊聯(lián)系人

李濤(1985-),女,在讀碩士,研究方向：食品安全與檢測。

國家自然科學基金項目資助 (30771675);上海市教育委員會重點學科建設項目資助(J50704)。