原子熒光光譜法測定六神丸的總砷含量及其在人工腸液中的可溶性砷含量

吳慶暉， 黃伯熹， 楊運(yùn)云， 張志軍， 黃璇瑩

（1.中國廣州分析測試中心，廣東省分析測試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

六神丸是著名的傳統(tǒng)中成藥，由清代名醫(yī)雷允上創(chuàng)制，已有100多年歷史。其處方由蟾酥、雄黃、麝香、珍珠、牛黃、冰片組成。具有解毒、消腫、止痛等多種功效［1］。六神丸的組方之一雄黃主含二硫化二砷(As2S2)［2］。由于其含砷量高，因過量服用六神丸而中毒的事件時(shí)有發(fā)生。中國藥典(2005版一部)附錄46對中成藥中砷的檢測采用古蔡氏法(砷斑法)或二乙基二硫代氨基甲酸銀法(銀鹽法)，這兩種方法操作繁瑣，需時(shí)較長，準(zhǔn)確度、靈敏度有限。原子熒光光度計(jì)測定六神丸的總砷含量及其在人工腸液中的可溶性砷含量方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道［3］，本方法具有靈敏度高，干擾少，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，能獲得較好的檢出限和精密度，為六神丸在臨床上的合理用藥和安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

AF-640雙道原子熒光光度計(jì)(北京瑞利儀器廠)；PYX-150S-C生化培養(yǎng)箱；Lab Tech可控溫電加熱板(北京萊伯泰科公司)；移液器 P5000(法國GILSON)；電子天平(Sartorius)BS 110S。

As標(biāo)準(zhǔn)貯備液 GSB G 62028-901000 μg/mL(國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院)；胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)；高純氬:＆gt；99.99%；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水采用去離子水。所有實(shí)驗(yàn)器具用前均以50%HNO3浸泡24 h并以去離子水洗凈備用。六神丸(蘇州雷允上藥業(yè)有限公司)。

1.2 儀器條件

經(jīng)優(yōu)化后的儀器條件如下:

HCL主陰極電流:35 mA；HCL輔助陰極電流:35 mA；PMT電壓:270 V；氬氣載氣流量:600 mL/min；氬氣輔助氣流量:100 mL/min；原子化器溫度:200℃；采樣泵速:100 r/min；采樣時(shí)間:4 s；注入泵速:100 r/min；注入時(shí)間:16 s；原子化方式:火焰法；讀數(shù)時(shí)間:14.0 s；延時(shí)時(shí)間:0.0 s；測量方法:標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方法:峰面積。還原劑:含4 g/L氫氧化鉀的1.4%硼氫化鉀(使用前配制)；預(yù)還原劑:50 g/L硫脲+50 g/L抗壞血酸(使用前配制)；載流:10%(V/V)鹽酸。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

用含10%HCl和10%預(yù)還原劑溶液把砷標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級稀釋至 0.00，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00，120.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。上機(jī)測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到線性回歸方程:I=84.03+124.9 C，回歸系數(shù)r=0.9998。

1.4 六神丸中總砷的測定

1.4.1 樣品前處理 取樣品約0.03 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，分別加入濃硫酸2 mL，高氯酸2 mL，濃硝酸2 mL，濃鹽酸2 mL。搖勻后置于電加熱板中在180℃溫度下進(jìn)行消化，消解至樣品冒白煙，若剩余消解液仍有棕色，取下冷卻，補(bǔ)加一定量濃硝酸繼續(xù)消解，至樣品冒白煙且顏色呈消解液無色透明，之后再持續(xù)消解5 min，以趕掉剩余的硝酸。冷卻，加入預(yù)還原劑2.5 mL，用去離子水把消解液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，定容。靜置15 min，待上機(jī)測定。

1.4.2 方法檢出限和重復(fù)性試驗(yàn) 對樣品空白溶液連續(xù)測定11次，用3倍的樣品空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差(3σ)除以標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率(b)求出本方法檢出限為0.12 ng/mL。平行處理7份樣品，進(jìn)行上機(jī)測定，測得樣品中砷的熒光強(qiáng)度值，計(jì)算得出砷含量的RSD為3.51%。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 另取一支樣品試液，在室溫20℃ ～25℃條件下每隔15 min測定1次，測得樣品中砷的熒光強(qiáng)度值，計(jì)算得出砷含量的RSD為3.96%。樣品試液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4.4 加樣回收試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知砷含量的六神丸5份，各0.03 g，分別加入1000 μg/mL砷標(biāo)液3 mL，按1.4.1項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，上機(jī)測定，砷回收率為93.6% ～104.1%。

1.4.5 樣品測定 取樣品批號為:HA 1005(20081007)的六神丸3份平行樣品，依1.4.1項(xiàng)方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測定，其總砷含量為:8.13%。

1.5 六神丸在人工腸液中可溶性砷的測定

1.5.1 人工腸液的配制

人工腸液 C1的配制［4］:取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000 mL即得。

不加胰蛋白酶的人工腸液C2的配制:不添加胰蛋白酶，其余均同人工腸液C1。

1.5.2 樣品溶液的配制

1.5.2.1 稱取六神丸100粒，計(jì)算每粒六神丸平均重量。然后用研缽研細(xì)，按四分法分樣，取約等于10粒六神丸重量的粉末樣品，精密稱定，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，加入人工腸液C1700 mL，此為樣品溶液L1。將其放置入生化培養(yǎng)箱中，在37.0℃條件下靜置。每隔一段時(shí)間(10、20、30、40、50、60、120、180、240、300、360 min)，用移液器吸取溶液清液 5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL比色管中，加入HCl 1.0 mL。上機(jī)前，加入預(yù)還原劑1.0 mL，加去離子水定容，靜置15 min，上機(jī)測定。

1.5.2.2 按1.5.2.1項(xiàng)進(jìn)行樣品溶液的配制，其中把人工腸液C1替換為不加胰蛋白酶的人工腸液C2，此為樣品溶液L2。

1.5.2.3 按1.5.2.1項(xiàng)進(jìn)行樣品溶液的配制，其中把人工腸液C1替換為去離子水，此為樣品溶液L3。

1.5.3 可溶性砷樣品溶液的測定結(jié)果 六神丸在人工腸液C1(L1)、不加胰蛋白酶的人工腸液C2(L2)、去離子水(L3)中不同時(shí)間段可溶性砷含量的測定結(jié)果(n=3)見表1，圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 本實(shí)驗(yàn)建立了原子熒光光譜法測定六神丸中的總砷含量，結(jié)果準(zhǔn)確、快速，靈敏度和精密度高，測定結(jié)果總砷含量為8.13%，折算為雄黃(As2S2)的含量為11.6%。文獻(xiàn)［5-6］中報(bào)道的含雄黃中成藥的雄黃含量范圍為:1.3%～14.3%。若按成人每日服用量30粒計(jì)，每日攝入的總砷為7620 μg。世界衛(wèi)生組織對標(biāo)準(zhǔn)體重60 kg成人總砷每日最大攝入量的限量標(biāo)準(zhǔn)為 128 μg。

表1 六神丸中可溶性砷含量的測定結(jié)果Tab.1 The determination results of soluble arsenic in Liushen Pills

圖1 六神丸在不同試液中隨時(shí)間變化的可溶性砷濃度變化趨勢Fig.1 The concentration change trend of soluble arsenic of Liushen Pills in different test solutions with time

2.2 目前我國對于中藥材和中成藥中有毒害元素砷的限量指標(biāo)僅見于中國藥典(2005版一部)中丹參、黃芪、甘草等6種中藥材。由于六神丸中含雄黃，雄黃的主要成分為As2S2，如果以總砷為指標(biāo)并作評價(jià)，會(huì)導(dǎo)致其砷含量大大超標(biāo)。有文獻(xiàn)［7-8］認(rèn)為雄黃的主要成分硫化砷很可能是不能被機(jī)體所吸收的無活性成分，其生物藥理活性為可溶性部分。本實(shí)驗(yàn)對六神丸在人工腸液中可溶性砷含量進(jìn)行了研究，測定結(jié)果為可溶性砷約占總砷含量的10.5%。若僅有可溶性砷全部被人體吸收，以成人每日服用量30粒計(jì)，每日攝入的可溶性砷約為800 μg。

2.3 本實(shí)驗(yàn)對六神丸在人工腸液中不同時(shí)間段(10、20、30、40、50、60、120、180、240、300、360 min)溶出砷的含量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明在10 min后，六神丸中的砷在人工腸液中的溶出達(dá)到平衡。這與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的六神丸中砷在家兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中達(dá)峰時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，說明六神丸中的可溶性砷在人體內(nèi)的溶出和被吸收速度快，這可能是在臨床上因過量服用六神丸造成急性中毒的原因之一。

2.4 本實(shí)驗(yàn)還考察了六神丸在人工腸液(L1)、不加胰蛋白酶的人工腸液(L2)、去離子水(L3)中可溶性砷含量的結(jié)果。結(jié)果表明，六神丸在不同溶液中可溶性砷的含量是:L1＆gt；L2＆gt；L3。此外，六神丸在人工腸液(L1)、不加胰蛋白酶的人工腸液(L2)中10 min后達(dá)到了溶出平衡，而作為對照組的去離子水(L3)中，六神丸要到20 min～30 min后才逐漸達(dá)到了溶出平衡。人工腸液中的胰蛋白酶作為一種生物活性大分子物質(zhì)，對六神丸中的砷溶出有促進(jìn)作用，而在去離子水中則需要更長的時(shí)間達(dá)到平衡。

［1］高學(xué)敏，李慶業(yè).實(shí)用中成藥［M］.北京:中國科技出版社，1991:138.

［2］中國藥典［S］.一部.2005:236.

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