白介素18髓核內(nèi)注射對兔椎間盤作用的實驗研究

陳操,秦超,劉維鋼,王維山,董金波,史晨輝

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石河子832002;

2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(新疆兵團(tuán)醫(yī)院),烏魯木齊810000)

白介素18髓核內(nèi)注射對兔椎間盤作用的實驗研究

陳操1,秦超1,劉維鋼2,王維山1,董金波1,史晨輝1

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,石河子832002;

2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(新疆兵團(tuán)醫(yī)院),烏魯木齊810000)

為探討白介素18(IL-18)髓核內(nèi)注射對兔椎間盤蛋白多聚糖和基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)的影響。方法采用健康大白兔72只,體重2.5～3 kg。隨機(jī)分為實驗組48只,陰性對照組16只,空白對照組8只。實驗組(IL-18組):隨機(jī)分為3組,每組16只。選擇L4～L5椎間盤,分別注射濃度為10 ng/μL、20 ng/μL、40 ng/μL的IL-18各1μL。陰性對照組(生理鹽水組):椎間盤內(nèi)注射1μL的生理鹽水?？瞻讓φ战M:不作任何處理。分別于第3、6周取相應(yīng)椎間盤作HE染色、免疫組織化學(xué)法檢測MMP-3的表達(dá)及蛋白多聚糖含量測定。結(jié)果顯示:①HE染色顯示,隨著IL-18濃度加大,髓核中細(xì)胞數(shù)量減少,正常組織結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重,空泡狀結(jié)構(gòu)減少,細(xì)胞核的形態(tài)由橢圓形變?yōu)槎喾N形態(tài)。②3周時陰性對照組及空白對照組髓核蛋白多聚糖沒有明顯變化,實驗組蛋白多聚糖下降明顯(15.72%～43.78%,P<0.001)。6周時陰性對照組及實驗組與空白對照組髓核蛋白多聚糖比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),并且實驗組蛋白多聚糖下降程度與IL-18注射劑量呈正相關(guān)(P<0.05))。③實驗組均發(fā)現(xiàn)表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,隨時間延長陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,并且陽性率與IL-18注射劑量及時間呈正相關(guān)(P<0.05)。3周時陰性對照組及空白對照組很少發(fā)現(xiàn)表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,而6周時陰性對照組MMP-3的陽性細(xì)胞表達(dá)增多,與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:椎間盤內(nèi)注射IL-18能夠?qū)е伦甸g盤內(nèi)蛋白多聚糖含量降低,促進(jìn)腰椎間盤內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)的表達(dá),可能加速椎間盤的退變,并且有量效關(guān)系。

白介素-18;椎間盤;蛋白多聚糖;金屬蛋白酶-3

Abstract:To investigate the in vivo effects of IL-18 on the content of aggrecan and the expression of MMP-3 on the intervertebral disc.Seventy-two healthy rabbits were randomly divided into three groups,including control group(no intervention of the disc),IL-18 group(IL-18 injectde into the intervertebral discs)and NaCl group(NaCl injectde into the intervertebral discs).L4/5 intervertebral discs were exposed surgically,0.9%NaCl(1μL)and various concentrations(10 ng/μL,20 ng/μL and 40 ng/μL)of IL-18(1μL)were respectiyely injected into L4/5 intervertebral discs.Aggrecan content neasuring and expression of MMP-3 on intervertebral disc were done when the animals were killed in the third and sixth weeks.Results Showed①The HE-staining showed that with the increase of IL-18 the amount of nucleus pulposus cells decreased,reticular framework was broken down,vacuole shape disappeared and oval nucleolus of cells became multi-shape.②In the third week,content of aggrecan had not changed apparently in control and NaCl groups,but in the experiment groups rapid decline(15.72%～43.78%,P<0.001)was evidenced.In the sixth week,content of aggrecan in Nacl group and experiment groups decline(P<0.05),and experiment groups decline were more correlative with the dose of IL-18(P<0.05).③In IL-18 groups the MMP-3 mascuLine cells had homogeneous distribution puncti form moth patch and were increase with the concentrations and the time(P<0.05).ln the third week,there was little expression of MMP-3 in control and NaCl group,but in the sixth week the expression of MMP-3 in NaCl group increased(P<0.05).IL-18 injected into the intervertebral discs can lead to decline of aggrecan and morphologicaL changes in the nucleus pulposus,which were related with dose of IL-18 adminstration.

Key words:interleukin-18;intervertebral disc;aggrecan;matrix metalloproteinase-3

椎間盤退變是引起下腰痛、腰腿痛及腰椎間盤突出癥的病理學(xué)基礎(chǔ),目前的研究發(fā)現(xiàn),炎性細(xì)胞因子在椎間盤退變的過程中發(fā)揮極其重要的作用[1]。IL-18是目前研究較多的炎性細(xì)胞之一,在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)等疾病中扮演重要角色[2]。隨著醫(yī)學(xué)分子學(xué)和病理學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn),其在退變的椎間盤組織中表達(dá)明顯增多,且能誘導(dǎo)前列腺素 E2生成,刺激軟骨細(xì)胞合成一氧化氮(NO)合酶,加速椎間盤病變惡化[3]。因此,我們選擇健康大白兔,采用髓核內(nèi)注射IL-18來觀察其對椎間盤組織的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗?zāi)Ｐ偷闹苽浜头纸M

健康大白兔72只,雌雄各半,年齡4～6個月,體重2.5～3.0 kg,(由石河子大學(xué)動物實驗中心提供)。IL-18由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。隨機(jī)選取48只作為實驗組,16只作為陰性對照組,8只作為空白對照組。麻醉成功后,動物俯臥位固定于兔臺,背部備皮,采用腰椎側(cè)方倒八字入路,切開皮膚及皮下組織,分離腹肌于腹膜外進(jìn)入腰椎側(cè)方,找到L4～L5椎體,咬除部分橫突,顯露顏色呈白色的L4～L5椎間盤。實驗組隨機(jī)分為3組,每組16只,用1μL的微量注射器分別注入 I L-18 10 ng/μL(實驗 A 組)、IL-18 20 ng/μL(實驗 A 組)、IL-18 40 ng/μL(實驗C組)各1μL 到L4～L5椎間盤髓核內(nèi)。陰性對照組(生理鹽水組)選擇L4～L5椎間盤內(nèi)注射1μL的生理鹽水?？瞻讓φ战M選擇L4～L5椎間盤不作任何處理。注射椎間盤節(jié)段采用黑色縫合線作標(biāo)記。以上各組,術(shù)后傷口無菌包扎,常規(guī)應(yīng)用青霉素肌注,每天每公斤體重20萬單位。連續(xù)注射10 d。術(shù)后兩周拆除皮膚縫線。常規(guī)飼養(yǎng),分別于第3、6周時各取8只兔子經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死,經(jīng)左腹前外側(cè)入路(手術(shù)方法同前)取出L4～L5椎間盤。將取出的每個椎間盤組織分為兩份。一份中性甲醛固定24h,另一份快速液氮冰凍保存。

1.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

將標(biāo)本置于10%中性福爾馬林液固定48 h,在Schmorl氏脫鈣液中脫鈣24 h以上,至完全脫鈣,流水沖洗24 h,逐級脫水和浸蠟,石蠟包埋,切制5 μm石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察。

1.3 蛋白多聚糖含量的測定

實驗采用以朱慶三等[4]所述Bitter法進(jìn)行蛋白多聚糖含量的測量。將液氮保存的每組取出的8個髓核置20 mL試管中,加丙酮2次,各6 h棄去,乙醚脫脂過夜后,置50℃恒溫箱干燥4 h;稱取脫脂髓核5 mg置10 mL試管中,加入木瓜酶消化液0.5 mL在60℃消化7 h(每2 h攪拌一次)冷卻至室溫加入30%TCA 0.25 mL,室溫放置2 h,3500 r/min離心5 min。取50μL上清樣本溶液,加蒸餾水2 mL。在有塞試管內(nèi)加入濃硫酸3 mL,冰水浴至4℃左右。取樣本或標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸溶液1 mL加入試管中冰水浴冷卻。將試管置沸水中加熱10 min,冷卻后加入咔唑試劑(0.125 g咔唑溶于100 mL乙醇)0.2 mL。再次沸水浴15 min,冷卻后530 nm處測定OD值。線性回歸分析得到吸光度與標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)樣本溶液OD值計算蛋白多聚糖含量。

1.4 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測

應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法檢測椎間盤組織中MMP-3的表達(dá)。MMP-3多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,一抗按1∶400稀釋。免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組織化學(xué)陽性對照為用含MMP-3豐富的乳腺癌病理切片代替實驗切片,實驗步驟相同,制備免疫組化陽性對照,結(jié)果為陽性。陰性對照為實驗時不加抗MMP-3的多克隆抗體。顯微鏡下觀察,免疫組織化學(xué)陽性染色為細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒,根據(jù)染色強(qiáng)度分為以下4個等級:-,無陽性細(xì)胞;+,陽性細(xì)胞 < 30%;++,陽性細(xì)胞占 3 0%～60%;+++,陽性細(xì)胞>60%。

1.5 資料收集和數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,采用統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)包SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計。多組數(shù)據(jù)之間均數(shù)比較采用單因素方差分析,然后采用LSD法行兩兩比較,兩組數(shù)據(jù)之間均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

HE染色顯示:空白組及陰性對照組纖維環(huán)仍保持著致密的板層結(jié)構(gòu),細(xì)胞成分較多,呈梭形纖維細(xì)胞樣或呈軟骨細(xì)胞樣。而實驗組隨著IL-18劑量增加及時間延長:髄核脊索細(xì)胞逐漸減少,并逐漸被纖維軟骨細(xì)胞替代,纖維環(huán)與髄核之間失去明顯的界限。且在實驗組與陰性對照組比較顯示了更多的髓核毛細(xì)血管侵入和炎性細(xì)胞浸潤,髓核及纖維環(huán)退變更嚴(yán)重,纖維細(xì)胞增生及瘢痕形成,見圖1。

2.2 蛋白多聚糖含量

各時間點實驗組蛋白多聚糖含量較正常對照組顯著下降。從量效關(guān)系來看,C組蛋白多聚糖含量下降高于B組,B組蛋白多聚糖含量下降高于A組;從時效關(guān)系來看各實驗組蛋白多聚糖含量下降值6周高于3周,見表1。

表1 髓核蛋白多聚糖含量的測定Tab.1 Results of nucleus pulposus proteoglycan content x±Sμ,g/mg

圖1 各組兔椎間盤組織HE染色顯微鏡觀察照片(100×)Fig.1 HE-staining results of each group rabbit lumbar intervertebral disc(100×)

2.3 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

MMP-3陽性結(jié)果表現(xiàn)為:細(xì)胞漿內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)觀察10個視野并記錄陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),該標(biāo)本陽性細(xì)胞率=10個視野(×400)×視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)÷10個視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)×100%,陽性細(xì)胞率<5%為陰性。實驗組與對照組陽性表達(dá)情況,實驗組明顯高于對照組,且隨著IL-18劑量增加及時間延長,實驗組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加,見表2。各組兔椎間盤組織MMP-3免疫組化染色顯微鏡觀察照片,見圖2。

表2 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Tab.2 Results of immunohistochemistry of MMP-3μ,g/mg

表2 MMP-3免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Tab.2 Results of immunohistochemistry of MMP-3μ,g/mg

注:與空白對照組比較:＊表示 P<0.05;與陰性對照組比較:Δ表示 P<0.05。同組不同時間比較用t檢驗。

組別 n 時 間3周 6周t P空白對照組 8 2.075±0.354 2.075±0.354 — —陰性對照組 8 2.125±0.238 5.020±0.627＊16.713 <0.05實驗A組 8 11.7±0.956＊Δ20.175±1.123＊Δ21.499 <0.05實驗B組 8 20.375±0.916＊Δ30.225±1.949＊Δ17.114 <0.05實驗 C組 8 30.575±1.017＊Δ41.400±1.792＊Δ19.657 <0.05 F 2027.568 1260.154 P<0.05 <0.05

圖2 各組兔椎間盤組織MMP-3免疫組化染色顯微鏡觀察照片(400×)Fig.2 MMP-3 immunohistochemistry coloured results of each group rabbit lumbar intervertebral disc(400×)

3 討論

IL-18主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,有許多生物學(xué)活性,刺激 T細(xì)胞增殖;誘導(dǎo) T細(xì)胞和自然殺傷(N K)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ;使 T細(xì)胞分泌 IL-2、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子(TNF-α);促進(jìn) T細(xì)胞、N K細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化成熟,增強(qiáng)N K細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[2]。誘導(dǎo) T細(xì)胞和N K細(xì)胞表達(dá) Fas配體(FasL)等。除此之外,IL-18還對 IL-8、單核細(xì)胞炎癥蛋白1(MIP-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)等趨化蛋白都有作用[5],而這些炎性因子反過來又促進(jìn)IL-18合成,從而形成正反饋,加重反應(yīng),使椎間盤內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步減少,從而加速了退變過程。椎間盤主要由膠原、蛋白多糖、彈性纖維、非膠原蛋白、糖蛋白等組成。其中,膠原和蛋白多糖是基質(zhì)的主要成分,其含量和成分改變被認(rèn)為是椎間盤退變最早出現(xiàn)的生化改變之一,并可直接導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)性能的改變,隨著年齡的增長,蛋白多糖的總量及糖胺多糖顯著減少[6],使膠原結(jié)構(gòu)變得脆弱,造成生物力學(xué)功能障礙,引起椎間盤退行性變。其中MMP-3是降解椎間盤組織中蛋白多糖聚合體及椎間盤內(nèi)多種基質(zhì)成分的主要酶,減少髓核的親水作用。通過降解連接蛋白破壞核心蛋白的透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)分解蛋白多糖聚合體,此外還可以降解多種膠原、層粘素、纖維連接素、明膠、基底膜和結(jié)締組織,并且可以通過激活其他MMPs起作用[7]。

最近的研究顯示,在人體退變的椎間盤組織中發(fā)現(xiàn)IL-18高表達(dá),認(rèn)為 IL-18參與了這個過程,并認(rèn)為是引起其退變的關(guān)鍵因子[8],但其引起椎間盤退變的機(jī)制鮮為人知,有關(guān)這方面的研究也少有報道。本研究以家兔為動物模型,通過向髓核內(nèi)注射不同劑量的IL-18,在不同的時間點觀察其對椎間盤蛋白多聚糖的影響并進(jìn)行MMP-3免疫組織化學(xué)檢測。本實驗結(jié)果顯示:從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),空白組及陰性對照組纖維環(huán)仍保持著致密的板層結(jié)構(gòu),纖維排列整齊,細(xì)胞成分較多,呈梭形纖維細(xì)胞樣或呈軟骨細(xì)胞樣。而實驗組隨著IL-18劑量增加及時間延長:纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂,髄核脊索細(xì)胞逐漸減少,并逐漸被纖維軟骨細(xì)胞替代,纖維環(huán)與髄核之間失去明顯的界限。且在實驗組與陰性對照組比較顯示了更多的髓核毛細(xì)血管侵入,髓核及纖維環(huán)退變更嚴(yán)重,纖維細(xì)胞增生及瘢痕形成。3周時陰性對照組及空白對照組髓核蛋白多聚糖沒有明顯變化,6周時陰性對照組與空白對照組髓核蛋白多聚糖比較有差異性(P<0.05),而實驗組蛋白多聚糖含量下降明顯(15.72%～43.78%,P<0.001),并且下降程度與 IL-18注射劑量呈正相關(guān)(P<0.01),表明椎間盤在IL-18的作用下蛋白多聚糖降解加劇或者合成明顯減少,并且和劑量呈正相關(guān)。而病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實驗組均有表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,且隨時間延長陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,并且陽性率與IL-18注射劑量呈正相關(guān)(P<0.01)。陰性對照組及空白對照組在3周時很少發(fā)現(xiàn)表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞,而6周時,陰性對照組表達(dá)MMP-3的陽性細(xì)胞較空白對照組表達(dá)增多(P<0.05),這與陰性對照組六周時蛋白多糖的降低一致,但沒有實驗組增多明顯,進(jìn)一步說明IL-18加速了椎間盤的退變過程,而IL-18是否直接促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)尚不能定論,需進(jìn)一步的研究。

本組實驗研究表明,小劑量 IL-18注射短期內(nèi)就可以引起蛋白多聚糖含量的明顯下降,在某種程度上說明了IL-18可以通過影響蛋白多聚糖含量的變化來導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變,從而加速了椎間盤的退變,為臨床通過抑制IL-18的作用來延緩椎間盤退變提供了一定的理論基礎(chǔ)。但是,IL-18與椎間盤內(nèi)其它炎性因子以及各種水解酶系相互間的作用,亦不甚清楚,如何通過改變 IL-18與其它炎性細(xì)胞因子以及各種水解酶的相互作用來達(dá)到預(yù)防和治療椎間盤病變需更進(jìn)一步的研究。

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Effects of Interleukin-18 on the Degeneration of Rabbit Lumbar Intervertebral Disc

CHEN Cao,QIN Chao,LIU Weigang,WANG Weishan,DONGJinbo,SHI Chenhui
(1 The First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Shihezi 832002,China;2 The Second Affiliated Hopspital of Medical College,Shihezi Univevsity,Wulumuqi 810000,China)

R681.53

A

1007-7383(2010)05-0587-05

2009-12-17

陳操(1983-),男,碩士生,專業(yè)方向為脊柱外科。

劉維鋼(1963-),男,教授,主任醫(yī)師,從事脊柱與骨組織工程的研究;e-mail:Liu-wg@163.com 。