新疆杏品種自交不親和S-RNase基因PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化

姜新,馮建榮,姜俊卿,王大江,劉月霞

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子832003)

新疆杏品種自交不親和S-RNase基因PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化

姜新,馮建榮,姜俊卿,王大江,劉月霞

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子832003)

以3個(gè)新疆杏品種的葉片為試材,以其葉片基因組DNA為模板,分別對(duì) PCR擴(kuò)增體系中的 10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、Taq DNA聚合酶和退火溫度5個(gè)因素設(shè)計(jì)6個(gè)梯度,研究了新疆杏品種自交不親和SRNase基因PCR擴(kuò)增條件,建立其優(yōu)化的PCR擴(kuò)增體系。研究結(jié)果表明:其擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min,25μL反應(yīng)體系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP 0.08 mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA 80 ng,DNA聚合酶1μL,此為最優(yōu)的反應(yīng)體系。

杏;自交不親和;S-RNase基因;體系優(yōu)化

Abstract:In this experiment,the leaves of three Xinjiang apricot cultivas were used as test materials,and their DNAs were used as templates,6 levels of 10×buffer,primer,dNTP mixture,DNA polymerase and annealing temperature were set in this experimentation to study the PCR amplification conditions of self-incompatibility S-RNase gene in Xinjiang apricost and establish optimal PCR ampilification system.The results showed that the amplification program was 94℃predegradation for 5 min,94℃degradation for 45 s,52℃anneal for 45 s,72℃extension for 2 min,after 35 cycles 72℃extension for 10 min;the 25μL reaction mixture contained 10×Buffer(include Mg2+)2.5μL,dNTP mixture 0.08 mmol/L,each primer 0.16μmol/L,DNA 80 ng,Taq DNA polymerase 1μL,which is the optimum system.

Key words:apricot;self-incompatibility;S-RNase gene;PCR system;optimization

新疆是世界杏的起源中心之一,具有豐富的杏品種資源[1]。2005年新疆杏的栽培面積達(dá)到1.5×105hm2,鮮杏產(chǎn)量70萬(wàn)t,已經(jīng)成為新疆僅次于葡萄、蘋(píng)果的第三大果品。新疆杏加工和鮮食特性?xún)?yōu)良,具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。自治區(qū)“十一五”園藝發(fā)展規(guī)劃,在2010年末新疆杏栽培面積要達(dá)到2×105hm2,屆時(shí)杏將成為新疆首要的特色果品之一。

新疆杏品種都屬于自交不親和的品種,其自交親和性普遍被認(rèn)為屬于S-RNase體系的配子體自交不親和體系,受1個(gè)具有復(fù)等位基因的S-位點(diǎn)控制,S-位點(diǎn)至少包括2個(gè)基因,1個(gè)在花柱中特異表達(dá),稱(chēng)花柱 S-RNase基因,另1個(gè)在花粉中特異表達(dá),稱(chēng)花粉SFB基因。當(dāng)雌雄性器官具有相同的S-等位基因時(shí),交配不親和,花粉管在花柱中生長(zhǎng)受到抑制,不能延伸生長(zhǎng)進(jìn)入子房;當(dāng)雌雄雙方的 S-基因不同時(shí),交配能親和,花粉能順利生長(zhǎng)進(jìn)入子房,完成受精[2]。研究建立優(yōu)化的 S-RNase基因 PCR擴(kuò)增體系有利于快速、準(zhǔn)確的鑒定自交不親和的SRNase基因型,為科學(xué)的配置杏授粉品種,提高杏的產(chǎn)量提供有利的技術(shù)支撐。

目前,關(guān)于利用特異引物PCR方法檢測(cè)杏的自交不親和S-RNase基因的報(bào)道有:Sutherland等[3]利用PCR技術(shù)對(duì)“Lambertin”等5個(gè)杏品種的S-基因進(jìn)行了擴(kuò)增;齊潔等[4]利用特異等位基因PCR方法鑒定了巴旦水杏(Prunus aremeniacaL.cv.Badanshui)、紅玉杏(P.aremeniacaL.cv.Hongyu)及凱特杏(P.aremeniaca L.cv.Katy)3個(gè)品種的SRNase基因;馮建榮等[5]利用特異PCR技術(shù)成功地在凱特(P.aremeniacaL.cv.Katy)和新世紀(jì)杏(P.aremeniacaL.cv.Xinshiji)上鑒定出了3個(gè)新的SRNase基因;張立杰等[6]利用PCR方法比較分析了5對(duì)薔薇科李屬通用的引物組合對(duì)30個(gè)中國(guó)杏品種S-基因特異PCR的擴(kuò)增效果。

本研究以新疆杏品種為試材,在前人的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步調(diào)整和優(yōu)化PCR體系的各組份和擴(kuò)增程序,旨在建立優(yōu)化的新疆杏品種S-RNase基因的PCR擴(kuò)增體系,為深入系統(tǒng)的研究新疆杏品種 SRNase基因型的鑒定提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

本實(shí)驗(yàn)材料均采于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺(tái)國(guó)家果樹(shù)資源圃,品種名分別為:蘇陸克、貝新納爾、辣椒杏,五月底采集剛成熟的嫩葉洗凈晾干后硅膠干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

10×Buffer(含Mg2+)和 Taq DNA聚合酶購(gòu)自廣東東盛公司 ;dNTP購(gòu)買(mǎi)自加拿大Bio Basic Inc公司。引物均由上海生工合成。

1.2 方法

利用CTAB法提取杏葉片基因組DNA,50μL TE溶解DNA產(chǎn)物,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 PCR體系、程序及檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用馮建榮等[5]報(bào)道的P系為參考體系,組分分別為:10×Buffer(含 Mg2+)2.5μL、dNTP 0.2 mmol/L、上下游引物:0.2 μmol/L(上游引物:5′-GGCCAAGTAATTATTCAAACC-3′,下游引物:5′-CATAACAAARTACCACTTCATGTAAC-3′)、 Taq DNA聚合酶 0.25μL、DNA 50～100 ng;擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),電壓120 V,電泳時(shí)間為25 min,溴化乙錠染色。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)體系中的4個(gè)組分和退火溫度均設(shè)6個(gè)梯度,如表1所示。

在進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化過(guò)程當(dāng)中,只調(diào)整單個(gè)試驗(yàn)因素的梯度水平,其他條件均按1.2.1中進(jìn)行設(shè)置。

表1 體系中4種組分和退火溫度梯度設(shè)計(jì)Tab.1 The gradient design of 4 compositions and annealing temperature of the system

2 結(jié)果與分析

2.1 10×Buffer(含Mg2+)濃度對(duì) PCR結(jié)果的影響

結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1顯示:梯度1～梯度4對(duì)3個(gè)新疆杏品種的PCR擴(kuò)增效果呈明顯的梯度差異,隨濃度的增加擴(kuò)增效果越來(lái)越好,但梯度4～梯度6的擴(kuò)增效果卻無(wú)明顯的變化。從最佳的擴(kuò)增效果和節(jié)省成本二方面判斷,10×Buffer(含Mg2+)在梯度4時(shí)的濃度為最佳選擇,為2.5μL。

圖1 不同10×Buffer(含Mg2+)濃度時(shí)3個(gè)杏品種PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification of PCR with different grads of 10×Buffer(Mg2+)for 3 apricot cultivars

2.2 dNTP濃度梯度對(duì)PCR結(jié)果的影響

結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2顯示,6種dN TP濃度對(duì)3個(gè)新疆杏品種的擴(kuò)增效果沒(méi)有明顯的差異,只有梯度1的擴(kuò)增效果稍差,其它基本相同。由此可見(jiàn),dN TP在梯度2時(shí)的濃度足以滿(mǎn)足25μL PCR擴(kuò)增體系中的需要,此時(shí)dNTP在體系中的濃度為0.08 mmol/L。

圖2 不同dNTP濃度時(shí)3個(gè)杏品種的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification of PCR with different grads of dNTP for 3 apricot cultivars

2.3 引物濃度梯度對(duì)PCR結(jié)果的影響

結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3顯示,6種引物濃度對(duì)3個(gè)新疆杏品種的擴(kuò)增效果具有一定的梯度差異,從梯度1到梯度4擴(kuò)增效果越來(lái)越好,從梯度4到梯度6擴(kuò)增效果沒(méi)有明顯的變化,說(shuō)明梯度4時(shí)引物的濃度已經(jīng)可以滿(mǎn)足25μL PCR擴(kuò)增體系的需要,此時(shí)上下引物的濃度為0.16μmol/L。

圖3 不同引物濃度時(shí)3個(gè)杏品種PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The amplification of PCR with different grads of concentrati f pims 3 ulv

2.4 Taq DNA聚合酶濃度梯度對(duì)PCR結(jié)果的影響

結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4顯示,6種 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)3個(gè)新疆杏品種的擴(kuò)增效果無(wú)明顯的梯度差異,只是在梯度1時(shí)擴(kuò)增效果稍差,其它5個(gè)梯度對(duì)3個(gè)品種的擴(kuò)增效果基本相同,因此,以節(jié)約成本為原則,選擇梯度2時(shí)的濃度最好,此時(shí),加入25μL體系中的Taq DNA聚合酶的用量為0.2μL。

圖4 不同Taq DNA聚合酶濃度時(shí)3個(gè)杏品種PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 The amplification of PCR with 6 different grads of concentration of TaqDNA polymarse for 3 apricot cultivars

2.5 退火溫度對(duì)PCR結(jié)果的影響

結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5顯示,不同的退火溫度對(duì)新疆杏品種的PCR擴(kuò)增結(jié)果差異較大。當(dāng)退火溫度較低時(shí),如梯度1和梯度2,3個(gè)新疆杏品種的PCR擴(kuò)增結(jié)果中均出現(xiàn)了非特異性條帶;當(dāng)退火溫度較高時(shí),如梯度4、梯度5和梯度6,3個(gè)新疆杏品種的 PCR擴(kuò)增結(jié)果中的條帶較暗甚至消失;而退火溫度在梯度3時(shí),3個(gè)新疆杏品種均擴(kuò)出了清晰的2個(gè)條帶。由此可見(jiàn),梯度3時(shí)的退火溫度為擴(kuò)增新疆杏品種的最優(yōu)退火溫度,此時(shí)的退火溫度為52℃。

圖5 6種退火溫度時(shí)3個(gè)杏品種PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The amplification of PCR with 6 different grads of concentration of Taq DNA polymerase for 3 apricot cultivars

3 討論

目前,特異引物PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于杏自交不親和相關(guān)S-RNase基因的檢測(cè),并且在部分杏品種上已經(jīng)成功的檢測(cè)到了相應(yīng)的S-RNase基因條帶,與此同時(shí)關(guān)于擴(kuò)增杏品種自交不親和SRNase的PCR擴(kuò)增體系也已經(jīng)有了一定的研究,但這些研究大都針對(duì)歐洲品種群和華北品種群。本研究以新疆杏品種(中亞品種群)為研究對(duì)象,建立了一種適合新疆地區(qū)杏品種的自交不親和S-RNase基因的擴(kuò)增體系,為快速、準(zhǔn)確的鑒定新疆杏品種的S-RNase基因型,科學(xué)配置授粉杏品種提供了有力的技術(shù)支撐。

由于在實(shí)際的DNA提取中,各個(gè)樣品的獲得率不完全相同,DNA濃度不可能完全一致,結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所提取的DNA濃度都能滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增的需要,而且它們之間的差異不會(huì)對(duì)PCR的結(jié)果產(chǎn)生影響。為此,在前人研究的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)忽略了由于DNA濃度的差異對(duì)PCR結(jié)果產(chǎn)生的影響,只對(duì) PCR體系中的 10×Buffer(含 Mg2+)、dNTP、上下游引物、DNA Taq酶、退火溫度5個(gè)反應(yīng)因子做了調(diào)整,同時(shí)本著最大限度降低成本的原則,從中選出了適合新疆杏品種PCR擴(kuò)增的各因子的使用量或溫度值。

通過(guò)比較,10×Buffer(含 Mg2+)、退火溫度 2個(gè)因子與前人的報(bào)道沒(méi)有變化,而dNTP、上下游引物、DNA Taq酶3個(gè)因子在用量上都有所降低,因此,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的體系在完成新疆杏品種 SRNase基因擴(kuò)增的同時(shí),在實(shí)驗(yàn)成本上有所降低,為今后新疆杏品種S-RNase基因的研究提供了更為經(jīng)濟(jì)、有效的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所得出的擴(kuò)增新疆杏品種S-RNase基因PCR優(yōu)化反應(yīng)體系程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min;25μL反應(yīng)體系成份為:10×Buffer(含 Mg2+)2.5μL,dNTP 0.08 mmol/L,上下引物0.16μmol/L,Taq酶1μL。

[1]陳學(xué)森,李憲利,張艷敏,等.杏種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及遺傳育種研究進(jìn)展[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2001,18(3):178-181.

[2]Kao T H,Tsukamoto T.The molecular and gentic bases of SRNase-based self-incompatibility[J].Plant Cell,2004,16:72-83.

[3]Sutherland B G,Robbins T P,Tobutt K R.Primers amplifying a range of Prunus S-alleles[J].Plant Breeding,2004,123:582-584.

[4]齊潔,顧曼如,束懷瑞.杏自交不親和相關(guān)S-RNase基因的克隆及表達(dá)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2003,11(2):148-153.

[5]馮建榮,陳學(xué)森,吳燕,等.杏自交不親和性 S-RNase基因型的檢測(cè)[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,25(2):168-171.

[6]張立杰,陳學(xué)森,陳曉流等.不同引物組合對(duì)中國(guó)杏品種資源S-基因特異擴(kuò)增效果比較[J].園藝學(xué)報(bào),2007,34(5):1141-114.

[7]馮建榮,陳學(xué)森,吳燕.‘凱特’與‘新世紀(jì)’杏自交不親和S-RNase基因的檢測(cè)及克隆[J].林業(yè)科學(xué),2006,42(10):129-132.

[8]尚明照,何寧,殷冬梅,等.花生基因組 SRAP-PCR體系的優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23(5):99-103.

[9]張發(fā),萬(wàn)勇善,劉風(fēng)珍.花生SSR-PCR體系的優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24(4)37-41.

[10]齊潔,顧曼如,束懷瑞.果樹(shù)自交不親和機(jī)制的研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2002,33(2):248-251.

[11]吳小麗,王述彬,曹碚生,等.辣椒 ISSR-PCR體系優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2007,29(2):288-291.

[12]趙懷寶,馮建榮,蔣迪軍,等.葡萄DNA提取與純化方法的比較研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2000,4(2):117-121.

[13]何天明,陳學(xué)森,吳燕.從薔薇科果樹(shù)硅膠干燥葉片中制備DNA[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,22(4):316-318.

[14]馬兵鋼,趙宗勝,馮建榮,等.梨屬DNA提純方法的比較研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2000,4(4)277-281.

[15]Halász J,Hegeds A,Hermán R,Stefanovits-Bányai,et al.New self-incompatibility alleles in apricot(Prunus armeniacaL.)revealed by stylar ribonuclease assay and S-PCR analysis[J].Euphytica,2005,145:57-66.

[16]M Tamura,M K Ushijima,H Sassa,et al.Identification of self-incompatibility genotypes of almond by allele-specific PCR analysis[J].Theor Appl Genet,2000,101:344-349.

[17]Sonneveld T,T P Robbins,R Boskovic,et al.T obutt.cloning of six cherry self-incompatibility alleles and development of allele-specifc PCR detection[J].Theor Appl Genet,2001,102:1046-1055.

[18]Wunsch,J I Hormaza.Cloning and characterization of genomic DNA sequences of four self-incompatibility alleles in sweet cherry(Prunus aviumL.)[J].Theor Appl Genet,2004,108:299-305.

Optimization of Self-Incompatibility S-RNase Gene PCR Ampilification System in Xinjiang Apricots

J IANG Xin1,FENGJianrong1,J IANGJunqing1,WANG Dajiang1,LIU Yuexia1
(College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S611.2

A

1007-7383(2010)04-0418-04

2010-01-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30370992),國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z109),國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD36B06)

姜新(1983-),男,碩士生,專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樾訕?shù)種質(zhì)資源與遺傳育種;e-mail:jiangxin831105@163.com。

馮建榮(1969-),女,教授,從事果樹(shù)種質(zhì)資源與分子輔助育種研究;e-mail:fengjr102@126.com。