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    Neurospora.crassa降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵工藝研究

    2010-10-27 03:24:42肖玉娟鄧澤元范亞葦胡蔣寧
    食品科學(xué) 2010年23期
    關(guān)鍵詞:皂素豆渣米糠

    肖玉娟,鄧澤元*,范亞葦,李 靜,劉 蓉,胡蔣寧

    (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室,高等研究院,江西 南昌 330047)

    Neurospora.crassa降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵工藝研究

    肖玉娟,鄧澤元*,范亞葦,李 靜,劉 蓉,胡蔣寧

    (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室,高等研究院,江西 南昌 330047)

    以提取茶皂素后的茶粕為材料,研究Neurospora.crassa(粗壯脈紋胞菌)降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵條件。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選定豆渣、米糠、含水量及發(fā)酵時間進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken實驗,建立粗纖維降解率的二次回歸方程,通過響應(yīng)面分析得到優(yōu)化組合工藝條件。結(jié)果表明:最佳的茶粕發(fā)酵條件為豆渣添加量29.38%、米糠添加量18.54%、含水量72%、發(fā)酵時間74.9h時,培養(yǎng)基粗纖維降解率達(dá)到最大值。該條件下粗纖維降解率預(yù)測值為48.65%,驗證值為48.36%。

    粗壯脈紋胞菌;茶粕;發(fā)酵條件;響應(yīng)曲面法優(yōu)化

    茶粕,又稱茶籽餅、茶麩、茶枯,呈紫褐色顆粒,是山茶科植物的果實榨油后剩下的渣,其中油茶茶籽粕和茶葉茶籽粕產(chǎn)量較大,其年均總產(chǎn)量約70萬t,是潛在的可利用茶粕資源[1]。目前,茶籽主要采用傳統(tǒng)的壓榨法榨油工藝制油, 所生產(chǎn)的茶粕中茶皂素、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量過高,不適宜直接用于動物飼料生產(chǎn),大部分被用作清塘劑、肥料、燃料,少量用于茶皂素的提取,極少部分用于飼料資源的開發(fā)應(yīng)用[2]。茶粕如果去除了有毒物質(zhì)茶皂素,其營養(yǎng)價值可與米糠媲美,且經(jīng)過微生物發(fā)酵后,可得到較高的菌體蛋白,提高了茶粕的利用價值[3]。因此,本實驗采用提取茶皂素(本課題組的專利技術(shù))后的茶粕為主要原料,利用實驗室自行篩選的一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的粗壯脈紋孢菌(Neurospora.crassa)降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維,以期在茶粕的動物飼料開發(fā)利用方面提供一種更為有效的途徑。

    響應(yīng)面分析(response surface methodology) 法是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具[4],將實驗中多因素與指標(biāo)的相互關(guān)系作近似擬合,可同時對影響生物產(chǎn)量的各因素水平及其交互作用進(jìn)行評價與優(yōu)化[5]。因此它能快速有效地確定多因子系統(tǒng)中的最優(yōu)條件,該法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化[6]。本實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選出對粗壯脈紋孢菌降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維具有顯著作用的4個因素的3個水平進(jìn)行Box-Behnken試驗,通過響應(yīng)面分析確定其最佳值、優(yōu)化工藝參數(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    粗壯脈紋孢菌(Neurospora.crassa)由本實驗室篩選保存。

    1.2 儀器與設(shè)備

    高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、移液器、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、電子天平、干燥箱、廣口瓶、調(diào)溫電熱套等。

    1.3 培養(yǎng)基

    斜面固體培養(yǎng)基:2%蛋白胨、 4%麥芽糖、1.5%~1.8%瓊脂,pH5.5~6.0。

    種子液培養(yǎng)基:葡萄糖10g、蛋白胨5g、 MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO41g、pH值自然,蒸餾水定容到1 L。

    1.4 方法

    1.4.1 種子培養(yǎng)

    從新鮮菌體活化培養(yǎng)基上取1環(huán)菌接入種子液培養(yǎng)基(30mL/250mL錐形瓶),于30℃、160r/min搖瓶培養(yǎng)3 6 h,備用。

    1.4.2 發(fā)酵方法

    在茶粕培養(yǎng)基中配入相應(yīng)比例的豆渣和米糠,裝入200mL的廣口瓶中,料層厚度控制在3~4cm,按不同的料水比加入水?dāng)噭颍邏簻缇?。接?mL/100g的種子液于固體培養(yǎng)基中,將廣口瓶置于恒溫恒濕箱中,在溫度為30℃,濕度為70%的條件下進(jìn)行好氧發(fā)酵[7]。

    1.4.3 含水量的測定

    茶粕培養(yǎng)基中配入豆渣和米糠后,加水浸潤,置于廣口瓶中,并用紗布和報紙蓋上,放入高壓滅菌鍋后,121℃滅菌30min。滅菌后的培養(yǎng)基105℃烘干至質(zhì)量恒定[8],含水量的計算公式如下:

    式中:m1為滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量;m2為干燥后培養(yǎng)基的質(zhì)量。

    1.4.4 粗纖維的含量測定及降解率的計算

    茶粕固態(tài)發(fā)酵樣品粉碎過篩孔尺寸為0.425mm的篩子,混勻后先用煮沸的體積分?jǐn)?shù)為1.25%的稀硫酸處理,以去除其中的糖、淀粉、果膠等酸溶性物質(zhì),再用煮沸的體積分?jǐn)?shù)為1.25%的氫氧化鈉溶液處理,以除去蛋白、脂肪等堿溶性物質(zhì)。最后用95%乙醇和無水乙醚處理除去單寧、色素以及殘余的脂肪,105℃烘干后所得殘渣即為粗纖維[9]。

    式中:m1為培養(yǎng)基發(fā)酵前粗纖維總質(zhì)量/g;m2為培養(yǎng)基發(fā)酵后粗纖維總質(zhì)量/g。

    1.5 粗壯脈紋胞菌降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的發(fā)酵條件優(yōu)化

    1.5.1 單因素對茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解率的影響

    影響粗壯脈紋胞菌生長及粗纖維降解率的因素很多[10],如添加的豆渣比例、米糠比例、培養(yǎng)基含水量、初始pH值及發(fā)酵時間等。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[11-12],選用豆渣10%、米糠20%、初始pH值自然、含水量68%、發(fā)酵時間72h為基本參數(shù)。確定一項最優(yōu)條件后,后續(xù)試驗均按前面的優(yōu)化值來進(jìn)行試驗。

    1.5.2 Box-Benhnken中心組合試驗

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,確定影響粗壯脈紋胞菌降解茶粕培養(yǎng)基粗纖維的顯著因素,采用Box-Benhnken試驗設(shè)計進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化[13]。得到的數(shù)據(jù)采用SAS 8.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,當(dāng)P<0.05時為顯著性水平。

    1.5.3 驗證實驗

    將優(yōu)化實驗所得的數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行回歸擬合,確定其極值點(diǎn)及其相應(yīng)自變量的取值,并進(jìn)行驗證實驗及可靠性分析。重復(fù)3次,用平均值進(jìn)行驗證比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 茶粕發(fā)酵過程中單因素對粗纖維降解率的影響

    2.1.1 豆渣比例對粗纖維降解率的影響

    圖1 豆渣比例對粗纖維降解率的影響Fig.1 Effect of soybean residue on the degradation rate of crude fiber

    如圖1所示,粗纖維降解率隨豆渣比例的增加而呈上升趨勢,當(dāng)向培養(yǎng)基中添加20%以上的豆渣時,粗纖維的降解率增幅減小,上升緩慢。為了多利用茶粕,故選擇豆渣比例為20%。

    2.1.2 米糠比例對粗纖維降解率的影響

    如圖2所示,粗纖維降解率隨米糠比例的增加,呈現(xiàn)先上升再下降的總體趨勢,在添加量為20%附近出現(xiàn)最大值。

    圖2 米糠比例對粗纖維降解率的影響Fig.2 Effect of rice bran on the degradation rate of crude fiber

    2.1.3 初始pH值對粗纖維降解率的影響

    如圖3所示,培養(yǎng)基的pH值會影響微生物的生長和酶的穩(wěn)定性,粗纖維降解率在初始pH6.0左右達(dá)到最大值,此后隨著pH值上升而逐漸降低,特別是pH值為8.0時,粗纖維降解率顯著降低。由于培養(yǎng)基的自然pH值在5~6之間,故選擇自然pH值發(fā)酵。

    2.1.4 含水量對粗纖維降解率的影響

    圖4 含水量對粗纖維降解率的影響Fig.4 Effect of water content on the degradation rate of crude fiber

    如圖4所示,粗纖維降解率隨培養(yǎng)基含水量的增加,呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,且增減幅度明顯,在含水量為70%附近達(dá)到最大值。初步確定含水量在70%時發(fā)酵效果最佳。

    2.1.5 發(fā)酵時間對粗纖維降解率的影響

    圖5 發(fā)酵時間對粗纖維降解率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the degradation rate of crude fiber

    如圖5所示,發(fā)酵時間是影響發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維含量的一個重要參數(shù)[14],主要取決于微生物的生長和代謝速率,還取決于基質(zhì)中的營養(yǎng)成分及內(nèi)部環(huán)境[15]。發(fā)酵時間太短,微生物不能充分利用碳源來生長,達(dá)不到理想的粗纖維降解效果;發(fā)酵時間太長,則生產(chǎn)周期變大,生產(chǎn)成本變高,而且容易滋生雜菌。在發(fā)酵初期,隨著發(fā)酵時間的延長,產(chǎn)品中粗纖維的含量逐漸減少,當(dāng)發(fā)酵時間為72h后,產(chǎn)品的粗纖維降解率增幅很低,故選用發(fā)酵時間72h左右為宜。

    2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化粗纖維降解率工藝條件

    根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理,綜合單因素試驗所得結(jié)果,確定發(fā)酵pH值為自然,選取豆渣比例、米糠比例、含水量和發(fā)酵時間4個對粗纖維降解率影響顯著的因素,分別以X1、X2、X3和X4代表,每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼(表1)。以茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解率為響應(yīng)值(Y),在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法,試驗因素與水平設(shè)計見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

    對豆渣比例X1、米糠比例X2、含水量X3和發(fā)酵時間X4作變換如下:X1=(A-20)/10,X2=(B-20)/10,X3=(C-70)/10,X4=(D-72)/12。以X1、X2、X3和X4為自變量, 以3次試驗所得粗纖維降解率的平均值為響應(yīng)值(Y),得到結(jié)果見表2,其中1~24是析因試驗,25~27是中心試驗,用來估計實驗誤差。

    表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

    從表3的回歸分析結(jié)果可以看出,用上述的回歸模型描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時,模型4個因素的P值均小于0.01,失擬項P=0.080434>0.05,表明該模型顯著;回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9662,表明該模型與實際實驗擬合較好,因此該模型可用于該菌對茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解的分析和預(yù)測?;貧w方程各項的方差分析結(jié)果還表明,自變量(豆渣比例、米糠比例、含水量和發(fā)酵時間)與響應(yīng)值(粗纖維降解率)之間線性關(guān)系極顯著(P<0.01);含水量對粗纖維降解率的曲面效應(yīng)極顯著;豆渣比例與米糠比例、豆渣比例與含水量的交互作用也極顯著;而X12、X22、X42、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4的作用不顯著。

    表3 響應(yīng)面試驗回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

    對茶粕培養(yǎng)基粗纖維降解率模型進(jìn)行求導(dǎo)和解逆矩陣可以得到模型的極值點(diǎn),豆渣為29.38%、米糠為18.54%、含水量為72%、發(fā)酵時間74.9h時,此時模型預(yù)測的最大響應(yīng)值為48.65%。

    2.3 驗證實驗

    為了檢驗?zāi)P皖A(yù)測的準(zhǔn)確性,在上述響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)化條件和原始菌體生長條件下進(jìn)行發(fā)酵實驗,重復(fù)3次實驗所得茶粕培養(yǎng)基粗纖維的降解率為48.36%,與模型預(yù)測的最佳值基本吻合。說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

    3 討 論

    3.1 培養(yǎng)基一定的載氧能力有利于粗壯脈紋胞菌的生長

    單因素試驗表明粗纖維降解率隨豆渣比例的增加而呈上升趨勢,當(dāng)培養(yǎng)基中豆渣比例超過20%時,粗纖維的降解率增幅減小,上升緩慢;同樣粗纖維降解率隨米糠比例的增加,呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,在米糠比例20%附近出現(xiàn)最大值。響應(yīng)面優(yōu)化得到豆渣為29.38%、米糠為18.54%時,粗壯脈紋胞菌生長好、粗纖維降解率最大。粗壯脈紋胞菌為需氧菌,培養(yǎng)基一定的載氧能力有利于該菌的生長和發(fā)育;而豆渣富含淀粉和纖維、米糠也富含纖維,他們的添加可以改善培養(yǎng)基的載氧能力,因此蓬松的原料有利于該菌的生長。在固態(tài)發(fā)酵中,適宜的發(fā)酵含水量,使得基質(zhì)顆粒之間膨松有空隙,疏松度合適,有助于菌體從中獲得營養(yǎng)及氧氣的傳遞。但是過高的含水量會導(dǎo)致基質(zhì)黏結(jié)成團(tuán),通氣性下降,影響氧的傳遞,導(dǎo)致酶活下降;而含水量過低,水的活度下降,不利于物質(zhì)傳遞,從而抑制粗壯脈紋胞菌對粗纖維的降解過程。

    3.2 茶粕通過粗壯脈紋胞菌發(fā)酵是一種較好的飼料資源

    我國可利用的茶粕資源十分豐富,但目前對茶粕的研究報道,大多專注于活性物質(zhì)茶皂素的提取,而把茶粕發(fā)酵成飼料的報道較少。通過脫茶皂素加工工藝生產(chǎn)的茶粕是一種良好的飼料原料。它含有多種對動物生長發(fā)育有利的必需微量元素,其中Mg、Ca、Fe、Zn、K、Cu的含量分別為:2730、1230、268.4、29.7、14790、17.28mg/kg;而據(jù)劉彥明等[16]的研究報道,茶粕中的有害元素Pb、Cd 的含量卻很低或近于零。經(jīng)粗壯脈紋胞菌發(fā)酵生產(chǎn)的茶粕發(fā)酵產(chǎn)品,粗纖維含量降低,從初始的21.52%降至14.15%,部分纖維素和木質(zhì)素成為了易消化的單糖或?qū)δc道細(xì)菌有益生作用的低聚糖,經(jīng)檢測,可溶性糖含量由初始的7.6%提高至35.97%。發(fā)酵后的粗蛋白含量提高,從初始的12.82%提高至18.34%,茶粕中的非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體真蛋白,產(chǎn)品的營養(yǎng)價值得到較大的提升。另外,粗壯脈紋胞菌是一株產(chǎn)β-胡蘿卜素能力較強(qiáng)的菌,其發(fā)酵后培養(yǎng)基中β-胡蘿卜素含量可達(dá)100mg/kg以上,這使茶粕發(fā)酵產(chǎn)品同時有望成為一種良好的蛋禽天然色素飼料??傊?,在動物生產(chǎn)中科學(xué)合理地使用茶粕發(fā)酵產(chǎn)品有利于緩解我國飼料資源緊缺的局面。

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    Fermentation Processing of Fiber Degradation from Oil-tea-cake Residue byNeurospora. crassa

    XIAO Yu-juan,DENG Ze-yuan*,F(xiàn)AN Ya-wei,LI Jing,LIU Rong,HU Jiang-ning

    (State Key Laboratory of Food Science and Technology, Institute for Advanced Study, Nanchang University,Nanchang 330047, China)

    The fermentation processing for fiber degradation from the residue of oil-tea-cake after the extraction of tea saponin was investigated. According to results of single-factor experiments, soybean residue, rice bran, water content and fermentation time were selected for the Box-Behnken design to establish a quadric regression equation for describing the degradation of fiber.The optimal fermentation conditions were achieved by response surface analysis to be soybean residue of 29.38%, rice bran of 18.54%, water content of 72% and fermentation time of 74.9 h. Under the optimal fermentation conditions, the highest degradation of fiber reached up to 48.65%, which was consistent with 48.36% of the validated value.

    Neurospora. crassa;oil-tea-cake;fermentation processing;response surface methodology

    TS201.3

    A

    1002-6630(2010)23-0243-05

    2010-07-23

    2010年江西省科技重大專項;食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室目標(biāo)導(dǎo)向課題(SKLF-MB-201003)

    肖玉娟(1986—),女,碩士研究生,主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail:xiaoyujuan0520@163.com

    *通信作者:鄧澤元(1963—),男,教授,博士,主要從事脂肪酸及天然產(chǎn)物研究。E-mail:dengzy28@yahoo.com.cn

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