反相高效液相色譜法測定軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白

曹 慧，許時嬰

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214036)

反相高效液相色譜法測定軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白

曹 慧1，許時嬰2

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214036)

建立了高效液相色譜法測定軟骨中Ⅱ型膠原蛋白的方法。以ZORBAX 300SB－C18為色譜分離柱，流動相:A為5%乙腈、0.05%TFA，B為80%乙腈(v/v)，采用線形梯度洗脫;檢測波長:220nm;流速:1mL/min，柱溫:35℃;進(jìn)樣量: 10μL。該方法對Ⅱ型膠原的檢出限為0.02mg/mL，線性范圍20～250μg/mL，樣品測定的變異系數(shù)為0.51%，加標(biāo)回收率為99.13%～100.06%。該方法具有快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、所需樣品用量少、易于自動化的優(yōu)點，從而為Ⅱ型膠原提供了一種新的測定方法。

高效液相色譜，II型膠原，軟骨

Ⅱ型膠原含量及其類型的確定對于Ⅱ型膠原的分離、提取、純化及其制品的應(yīng)用具有重要的作用。到目前為止，Ⅱ型膠原的測定方法主要有蛋白質(zhì)總量的測定、Woessner比色法與免疫學(xué)檢測法［1－2］。比色法，又稱分光光度法，是一種傳統(tǒng)的測定膠原含量的方法。由于其操作方法簡便，實驗條件要求不高，因此作為一種有效的膠原含量測定方法被廣泛采用，但此法只能測定毫克級的羥脯氨酸，不能區(qū)分膠原的類型，且操作繁瑣，只能測定總膠原的含量。免疫組織學(xué)方法可檢測各種組織中多種類型膠原的分布及病變時各型膠原的變化［3］，但采用這種方法所需費用昂貴，并不適合在生產(chǎn)實際中應(yīng)用。高效液相色譜分離法具有分析速度快、樣品用量少、靈敏度高、分離和檢測一次完成，易于實現(xiàn)自動化，可在工業(yè)流程中應(yīng)用等優(yōu)點［4－5］。因此，本文采用高效液相色譜技術(shù)建立Ⅱ型膠原的測定方法，尋求一種快速、精確的Ⅱ型膠原的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

軟骨 內(nèi)蒙古草原興發(fā)集團(tuán);乙腈 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純;Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;其余試劑 均來自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

LGJ－100型真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;ZX－1型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所;CL20－B型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV－1100型紫外－可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;HP1100型高效液相色譜儀 配有可變波長紫外檢測器，美國Aglient。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX 300 SB－C18(4.6mm×250mm，5μm);流動相:A為 5%乙腈、0.05%TFA，B為80%乙腈(v/v);采用線形梯度洗脫;檢測波長:220nm;流速:1mL/min;柱溫:35℃，進(jìn)樣量:10μL。實驗用水、流動相均先用0.45μm孔徑濾膜過濾，再經(jīng)超聲波脫氣30min。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取實驗室制備的冷凍干燥后的Ⅱ型膠原樣品100.05mg于容量瓶中［6］，加入0.01mol/L的醋酸定容至50mL。量取15mLⅡ型膠原蛋白溶液，高速冷凍離心10min(4℃，10000r/min)，上清液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾后進(jìn)樣。以保留時間定性，峰面積定量。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及線性范圍 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ型膠原50mg溶于50mL容量瓶中，加入0.01mol/L的醋酸定容，制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用儲備液配制Ⅱ型膠原系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:5、10、20、40、60、80、100μg/mL。以峰面積積分值對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行直線回歸。

1.2.4 回收率實驗 采用加樣回收法，取已知含量的樣品溶液6份，分別加入低、中、高3種濃度的Ⅱ型膠原對照組溶液，按1.2.2項下的方法進(jìn)行實驗，記錄峰面積并代入回歸方程，計算Ⅱ型膠原的濃度，以測得量與加入量之比計算平均回收率。

1.2.5 精密度實驗 取對照組溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，分別測定峰面積，計算變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

取Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品溶解于0.5mol/L的醋酸中，在200～300nm之間進(jìn)行紫外掃描。由圖1可見，Ⅱ型膠原紫外最大吸收波長在220nm。

圖1 Ⅱ型膠原的紫外掃描圖

2.2 不同乙腈配比對Ⅱ型膠原測定結(jié)果的影響

流動相的物理化學(xué)性質(zhì)對色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性、分離效率、分離速度、檢測靈敏度具有重要的影響。以5%乙腈、0.05%TFA為流動相A，80%乙腈(v/v)為流動相B，采用梯度洗脫程序，比較流動相配比對分離效果的影響。由表1可見，當(dāng)初始流動相B的配比較小時，膠原不易分離，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。當(dāng)初始流動相B的比例逐漸增大時，Ⅱ型膠原組分能得到有效分離，峰型對稱性也較好，同時保留時間逐步縮短，測定值逐步穩(wěn)定，且Ⅱ型膠原組分得到有效分離。當(dāng)初始流動相B的比例較大時，峰型對稱性差，測定值偏低。因此，流動相B的梯度洗脫程序如表2所示。應(yīng)用表2條件獲得的Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品梯度洗脫的色譜圖及軟骨Ⅱ型膠原的色譜圖分別如圖2和圖3所示。

表1 乙腈濃度對Ⅱ型膠原測定結(jié)果的影響

表2 Ⅱ型膠原的梯度洗脫程序

圖2 Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

圖3 軟骨Ⅱ型膠原的HPLC色譜圖

2.3 不同流速對Ⅱ型膠原測定結(jié)果的影響

流動相的流速是影響色譜柱效、控制色譜分離度和分析速度的重要參數(shù)［7］。因此考察了不同流速對Ⅱ型膠原測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表3。由表可見，隨著流速的提高，Ⅱ型膠原的保留時間逐漸降低，當(dāng)流速為1mL/min時，保留時間為8.395min，樣品中各個組分能完全分開。而當(dāng)流速為0.2mL/min時，保留時間為15.053min，各個組分并不能分開，積分時峰面積增大，從而導(dǎo)致測定值偏高。這可能是由于流速的增加，加速了樣品中各個組分在流動相和固定相的分配，從而改善了樣品中各組分的分離度及出峰時間，因此選擇流動相速度為1mL/min。

2.4 Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱?、蛐湍z原標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個濃度進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10μL，以樣品濃度增量為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)行相關(guān)性分析。得到標(biāo)準(zhǔn)方程為:y=2794.7x－81338，R2=0.998。從圖4可以看出，Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.02～0.25mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3 不同流速對膠原蛋白測定的影響

圖4 Ⅱ型膠原測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 高效液相色譜法精密度實驗

取濃度為0.8mg/mL的對照組溶液，按HPLC色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，測定結(jié)果見表4。從表4的結(jié)果可知，該測定方法的變異系數(shù)CV為0.51%，小于5%，符合測定要求。

表4 Ⅱ型膠原測精密度實驗

2.6 高效液相色譜法回收率實驗

精確量取6份已知含量樣品1mL。其中三份用于測定本底值，另外三份添加不同濃度的Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法處理樣品，分別取10μL進(jìn)樣，每個樣品重復(fù)3次，按峰面積計算回收率。結(jié)果見表5。從表中可以看出，利用高效液相色譜法測定樣品中的Ⅱ型膠原的回收率在99.13%～100.06%之間，因此方法的準(zhǔn)確度可以滿足檢測軟骨中Ⅱ型膠原含量的要求。

表5 Ⅱ型膠原回收率

2.7 樣品檢測結(jié)果

對來自不同部位軟骨的Ⅱ型膠原進(jìn)行測定，測定結(jié)果如表6所示。

表6 樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 建立了測定軟骨中Ⅱ型膠原的色譜方法:色譜柱為ZORBAX 300 SB－C18，流動相A為5%乙腈、0.05%TFA，B為80%乙腈(v/v)，流速為1mL/min，柱溫為35℃。在此條件下Ⅱ型膠原的損失最小，回收率為99.13%～100.06%，變異系數(shù)為0.51%，達(dá)到了檢測要求。

3.2 方法所用試劑配制簡單，在保證準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的基礎(chǔ)上，具有快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、所需樣品用量少、易于自動化的優(yōu)點，從而為Ⅱ型膠原提供了一種新的測定方法。

［1］Woessner J F.The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid［J］.Arch Biochem Biophys，1961，93:440－447.

［2］馮志民，徐蘅.動物組織鐘羥脯氨酸測定方法的建立及初步應(yīng)用［J］.南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1999，18(3):168－170.

［3］殷明文，南宇梅，王新民.分光光度法測定羥脯氨酸的改進(jìn)［J］.河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1994，29(1):74－77.

［4］HutsonP R，CrawfordM E，SorknessR L.Liquid chromatographic determination of hydroxyproline in tissue samples［J］.Journal of Chromatography B，2003，791:427－430.

［5］鄒曉莉，黎源倩，曾紅燕.反相高效液相色譜法測定人肌腱中的膠原蛋白［J］.色譜，2006，24(3):263－266.

［6］曹慧，許時嬰.雞關(guān)節(jié)軟骨II型膠原的制備［J］.食品科學(xué)，2007，28(4):148－151.

［7］Green G D，Reagan K.Determination of hydroxyproline by high pressure liquid chromatography［J］.Anal Biochem，1992，201:265－269.

Determination of type II collagen in cartilage by reversed－phase high performance liquid chromatography

CAO Hui1，XU Shi－ying2
(1.Medical Equipment and Food Institute，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China;
2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China)

Reversed－phase high performance liquid chromatography(RP－HPLC)method was demonstrated to determine the concentration of type II collagen in cartilage.Chromatography was performed with ZORBAX 300 SB－C18and an injection volume of 10μL.The mobile phase consisted of two solvent:(A)5%acetonitrile and 0.05% trifluoroacetic(TFA)and(B)80%acetonitrile(v/v).The separation was performed using the linear gradient of AB(v/v).Flow rate was maintained 1mL/min.Absorbance was monitored at 220nm.The linear range was from 20μg/mL to 250μg/mL and the detection limit was 20μg/mL.The variation coefficient of determination was 0.51%.The recoveries of spiked samples were 99.13%～100.06%.The RP－HPLC has proved to be convenient，sensitive，accurate and reproducible on base of avoiding the use of a time－consuming pretreatment procedure.

high performance liquid chromatography;type II collagen;cartilage

TS201.2+1

A

1002－0306(2010)08－0348－03

2009－09－01

曹慧(1976－)，女，講師，主要從事功能性食品配料及安全方面的研究。