利用光生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻的研究初探

沈 淵, 蔡明剛,2, 黃水英, 石榮貴, 李 哲, 陸曉霞

(1. 廈門大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院, 福建 廈門 361005; 2. 福建省海洋化學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門361005)

利用光生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻的研究初探

沈 淵1, 蔡明剛1,2, 黃水英1, 石榮貴1, 李 哲1, 陸曉霞1

(1. 廈門大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院, 福建 廈門 361005; 2. 福建省海洋化學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門361005)

用光生物反應(yīng)器與光照培養(yǎng)箱兩種培養(yǎng)容器培養(yǎng)雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis), 對雨生紅球藻在兩種容器培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長、pH值、溶解氧(DO)及蝦青素積累情況進(jìn)行比較, 同時(shí)比較不同接種密度對光生物反應(yīng)器培養(yǎng)效果的影響。實(shí)驗(yàn)表明, 光生物反應(yīng)器中藻細(xì)胞的調(diào)整期較短, 接種1 d后即進(jìn)入指數(shù)生長階段, 在脅迫階段則僅需4 d即達(dá)到蝦青素含量的峰值; 將pH值控制在偏堿性條件下(7.75±0.10)有利于藻細(xì)胞更好生長; 營養(yǎng)培養(yǎng)階段DO相對飽和度上升至80%, 而在脅迫階段則迅速降低, 最低值小于6%; 較高的接種密度(2.3×104個(gè)/mL)具有較短的營養(yǎng)培養(yǎng)周期(7 d), 且因接種密度變化對脅迫周期長短無明顯影響(均為4 d), 選用較高的接種密度可望降低工業(yè)生產(chǎn)成本。

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis); 蝦青素; 光生物反應(yīng)器; 培養(yǎng); 積累

蝦青素(astaxanthin)是一種紅色的酮式類胡蘿卜素, 因其強(qiáng)抗氧化能力而具有抗癌、增強(qiáng)免疫、抗紫外線、著色等功效[1～6]。天然蝦青素具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景, 且需求量不斷增加[2,3]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細(xì)胞綠藻, 其蝦青素含量約占細(xì)胞干質(zhì)量的 1.5%～3.0%, 被公認(rèn)為天然蝦青素的濃縮體[2]。目前, 如何利用雨生紅球藻實(shí)現(xiàn)蝦青素高產(chǎn)已成為國際研究的熱點(diǎn)。然而, 雨生紅球藻生長緩慢、易受污染, 且生長適宜溫度較低等特點(diǎn)使得雨生紅球藻的大規(guī)模高密度培養(yǎng)受到限制[7,8]。為進(jìn)行藻細(xì)胞的大體積生產(chǎn), 國外學(xué)者普遍采用封閉式光生物反應(yīng)器[9～11]。

光生物反應(yīng)器是一種微藻培養(yǎng)設(shè)施或裝置, 目前主要分開放式光生物反應(yīng)器和封閉式光生物反應(yīng)器兩大類。前者結(jié)構(gòu)簡單、投資成本低、技術(shù)要求較低, 但卻存在培養(yǎng)條件難以控制、易受環(huán)境污染等缺點(diǎn), 比較不適合雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)。后者能較好地控制培養(yǎng)環(huán)境, 保護(hù)微藻不受周圍環(huán)境的污染, 實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度培養(yǎng)[9,12]。近年來, 封閉式光生物反應(yīng)器發(fā)展迅猛, 國外學(xué)者關(guān)于利用封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻的研究報(bào)道已有不少, 且主要集中在立柱式、平板式和管狀式等3大類型, 其研究重點(diǎn)已從反應(yīng)器的應(yīng)用轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)改進(jìn)以及培養(yǎng)參數(shù)(通氣速率、質(zhì)量傳輸速率研究等)的優(yōu)化[9,10,13～18]。國內(nèi)研究則多數(shù)集中在少數(shù)反應(yīng)器的應(yīng)用上[19～21], 總體而言, 國內(nèi)研究廣度和深度不及國外。

光強(qiáng)、攪拌速率、通氣速率、pH、溶解氧(DO)、接種密度等均可影響雨生紅球藻生長。雨生紅球藻對pH的緩沖能力較弱, 培養(yǎng)過程中營養(yǎng)鹽和CO2的消耗將逐漸升高藻液 pH[22,23], 從而影響藻細(xì)胞生長。培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度逐漸增加, 細(xì)胞容易發(fā)生貼壁、沉降, 反應(yīng)器的攪拌和充氣系統(tǒng)可在一定程度上緩解上述現(xiàn)象。充氣速率高低也將影響藻生長, 充氣可對細(xì)胞產(chǎn)生懸浮作用, 并補(bǔ)充溶解氧, 但若體系溶氧過高, 細(xì)胞生長則會(huì)受抑制[7,24,25]。此外, 選擇恰當(dāng)?shù)慕臃N密度有利于使?fàn)I養(yǎng)鹽利用與細(xì)胞生長維持在較佳的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài), 進(jìn)而縮短培養(yǎng)周期并提高最終蝦青素含量。

針對上述影響因素, 本文對雨生紅球藻培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長情況、蝦青素、總?cè)~綠素、pH值、DO變化及不同接種密度對細(xì)胞培養(yǎng)的影響進(jìn)行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

本實(shí)驗(yàn)所用雨生紅球藻原始藻種由中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用BBM培養(yǎng)基。

1.2.2 利用光生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻

利用20 L NHL-Ⅲ型光生物反應(yīng)器(煙臺(tái)高新區(qū)海洋生物工程研究所)培養(yǎng)雨生紅球藻原始藻種。反應(yīng)器由發(fā)酵罐、光照系統(tǒng)、滅菌系統(tǒng)、通氣系統(tǒng)、控制系統(tǒng)5部分組成, 反應(yīng)器配有pH值和攪拌速度自動(dòng)控制系統(tǒng), 系統(tǒng)面板可顯示溫度、pH值、攪拌速度和溶解氧。

實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理, 冷卻至室溫后加BBM 培養(yǎng)基及藻液, 接種密度分別為 2.3×104個(gè)/mL和 0.84×104個(gè)/mL。營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)階段和脅迫階段的光強(qiáng)分別為1.1～1.3 klx和10～11 klx; 溫度控制在23 ℃ ± 1 ℃ ; pH 值控制在 7.75±0.10; 通氣速率約為2.0 L/min。每日取2 mL藻液測細(xì)胞密度。

1.2.3 利用三角燒瓶培養(yǎng)雨生紅球藻

在光照培養(yǎng)箱中用 250 mL 的三角燒瓶接種處于對數(shù)生長期的原始藻種, 作為對照組, 設(shè)置3個(gè)平行。接種密度為2.3×104個(gè)/mL, 1.1～1.3 klx光強(qiáng)連續(xù)光照, 溫度為23.0 ℃。每日取2 mL藻液測細(xì)胞密度, 同時(shí)用pH 計(jì)測定pH值。每日搖藻3次, 防止藻細(xì)胞粘壁。

1.3 測定方法

利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按公式K=(lnNt- lnN0)/t計(jì)算生長速率K, 其中Nt,N0分別為t時(shí)刻和初始時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 取全部藻懸浮液,離心去上清液后干燥冷卻至衡質(zhì)量, 計(jì)算單位體積藻粉產(chǎn)率。

采用高效液相色譜(HPLC)法分析測定蝦青素含量。色譜柱為Hypersil ODS(5 μm, 4.6 mm×250 mm,Germany)色譜柱; 流動(dòng)相為乙腈、甲醇和水(75：25：10,體積：體積：體積); 流速為1.0 mL/min; 用二極管陣列檢測器(DAD)在 250～700 nm 波長范圍內(nèi)掃描, 在476 nm處進(jìn)行檢測; 進(jìn)樣量為10 μL。

利用752型分光光度計(jì)于664, 647, 630 nm波長處測定吸光值并求算葉綠素含量(取λ=750 nm的吸光值校正)。

2 結(jié)果與討論

2.1 光生物反應(yīng)器中雨生紅球藻的營養(yǎng)培養(yǎng)

2.1.1 光生物反應(yīng)器中雨生紅球藻營養(yǎng)階段的細(xì)胞生長

圖 1為不同培養(yǎng)條件下, 雨生紅球藻的細(xì)胞生長曲線圖。由圖 1可知, 光生物反應(yīng)器(接種密度為2.3×104個(gè)/mL)與光照培養(yǎng)箱中三角燒瓶(約 100 mL)的培養(yǎng)效果不同： 前者中藻細(xì)胞調(diào)整期較短, 接種1 d后即進(jìn)入指數(shù)生長狀態(tài), 7 d后, 藻液顏色顯著加深(圖2a, b), 細(xì)胞密度達(dá)3.04×105個(gè)/mL, 為初始密度(2.3×104個(gè)/mL)的 15倍, 是三角燒瓶最大藻密度(2.54×105個(gè)/mL)的1.2倍; 平均生長速率為0.37 d-1,明顯高于利用太陽光進(jìn)行室外大體積(10 L)培養(yǎng)的平均生長速率(0.10 d-1)[26]; Kaewpintong等[9]利用對鼓泡塔式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻(NIES 144),其細(xì)胞平均生長速率為0.36 d-1, 與本實(shí)驗(yàn)相近?？梢? 雨生紅球藻在該光生物反應(yīng)器中能達(dá)到快速生長的效果。

2.1.2 pH值對營養(yǎng)階段細(xì)胞生長的影響

實(shí)驗(yàn)中, 光生物反應(yīng)器中的 pH值自動(dòng)控制在7.75±0.10, 三角燒瓶中pH值不控制。圖3為三角燒瓶中雨生紅球藻營養(yǎng)階段的pH變化曲線。由圖3可知, 藻液pH值隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸升高, 7 d后超過9.0,達(dá) 9.35, 可見雨生紅球藻在培養(yǎng)過程中是逐漸產(chǎn)堿的, 該現(xiàn)象與其他研究報(bào)道[22,27]相符。已有研究認(rèn)為,紅球藻游動(dòng)細(xì)胞可以耐受比較廣的 pH值范圍, 在pH為5.0～10.0之間可以存活并旺盛生長, 相對而言,pH值為 7～8時(shí)對細(xì)胞生長更有利一些[23], 而當(dāng) pH超過 10.0時(shí), 將嚴(yán)重抑制雨生紅球藻的生長[28]。本實(shí)驗(yàn)中光生物反應(yīng)器中的 pH控制在偏堿性條件下(7.75±0.10), 與對照組相比, 藻細(xì)胞的生長得到了明顯的改善(圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)條件下雨生紅球藻的生長曲線Fig. 1 Grow curves of Haematococcus pluvialis cultured under different culture conditions

圖2 光生物反應(yīng)器中藻液顏色的變化Fig. 2 Color change of alga liquor at different times in photobioreactora. 接種后藻液的顏色; b. 培養(yǎng)7 d后藻液的顏色; c. 脅迫4 d后藻液的顏色(右下角為單個(gè)細(xì)胞的鏡檢圖)a. alga liquor just after inoculation; b. alga liquor after a seven-day culture period; c. alga liquor after four-day stress period (the picture in the bottom right corner is the single cell under microscope)

圖3 三角燒瓶中pH隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig. 3 pH variation with the increase of culture time

2.1.3 光生物反應(yīng)器中DO相對飽和度變化初探

圖4為光生物反應(yīng)器(接種密度為2.3×104個(gè)/mL)中DO相對飽和度的變化曲線。由圖4可知, 培養(yǎng)初期 DO相對飽和度迅速上升, 第 5天達(dá)峰值(80%),營養(yǎng)階段末期(第6天)DO開始降低, 脅迫開始后DO急劇下降, 至后期DO相對飽和度均小于6%。培養(yǎng)初期藻細(xì)胞大量分裂繁殖, 光合作用大于呼吸作用,DO迅速上升, 脅迫后一方面由于營養(yǎng)鹽的消耗導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量降低, 另一方面藻細(xì)胞開始轉(zhuǎn)變?yōu)榫吆癖诘撵o孢子[29], 光合作用受阻, 導(dǎo)致DO下降。

圖4 光生物反應(yīng)器中DO相對飽和度隨時(shí)間的變化Fig. 4 DO change with the increase of culture time

2.2 光生物反應(yīng)器中雨生紅球藻脅迫階段各指標(biāo)的變化

2.2.1 細(xì)胞密度變化及色素的積累

脅迫階段的細(xì)胞密度變化和色素積累情況如圖5、圖6所示。由圖5可知, 細(xì)胞密度隨脅迫時(shí)間的延長呈明顯下降趨勢。脅迫前4 d, 細(xì)胞密度急劇下降, 第4天降至7.45 ×104個(gè)/mL, 降幅高達(dá)75%, 此后細(xì)胞密度呈小幅降低, 最終藻細(xì)胞密度為4.95×104個(gè)/mL。同時(shí), 脅迫期間蝦青素質(zhì)量濃度先增加后減小, 總?cè)~綠素質(zhì)量濃度則平穩(wěn)下降(圖 6)。脅迫第1天, 蝦青素質(zhì)量濃度便有明顯積累, 此后3 d內(nèi)平穩(wěn)上升, 當(dāng)脅迫至第4天時(shí), 蝦青素質(zhì)量濃度即達(dá)峰值, 為10.08 mg/L。高光脅迫會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞部分死亡, 并減緩剩余存活細(xì)胞的分裂速度, 同時(shí)使細(xì)胞逐漸失去鞭毛, 呈不動(dòng)狀態(tài), 并在細(xì)胞內(nèi)不斷積累蝦青素[23]。因此脅迫期間細(xì)胞密度和葉綠素質(zhì)量濃度逐漸下降, 而蝦青素質(zhì)量濃度卻增加。在脅迫后期, 細(xì)胞不斷死亡, 故蝦青素質(zhì)量濃度有所降低(圖 6)。

圖5 光生物反應(yīng)器中細(xì)胞密度隨脅迫時(shí)間的變化Fig. 5 Changes of cell density with the increase of stress duration

圖6 蝦青素和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度的比較Fig. 6 Comparison of astaxanthin content and total content of Chlorophyll at stress stage

2.2.2 不同培養(yǎng)容器脅迫效果的比較

不同培養(yǎng)容器脅迫效果如表 1所示。與對照組(三角燒瓶)脅迫比較, 光生物反應(yīng)器脅迫的綜合效果不如對照組, 脅迫后細(xì)胞存活率僅為16.4%, 僅為對照組(31.5%)的 50%左右; 藻粉產(chǎn)率為 0.517 g/L,與對照組相當(dāng); 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(脅迫 7 d)測得蝦青素產(chǎn)率為3.73 mg/L , 僅為對照組的42.8%。光生物反應(yīng)器脅迫的綜合效果較差, 這可能與光生物反應(yīng)器的培養(yǎng)體積較大(12.5 L, 為對照組的125倍)有關(guān)。培養(yǎng)容器內(nèi)徑大, 藻液遮擋效應(yīng)明顯, 導(dǎo)致容器內(nèi)部脅迫光強(qiáng)不足, 使得部分細(xì)胞脅迫不完全, 蝦青素的積累量不高, 鏡檢也發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞內(nèi)并未完全充滿蝦青素(圖2c)。在后續(xù)試驗(yàn)中, 可以考慮通過縮短培養(yǎng)容器內(nèi)徑或適當(dāng)增加光照強(qiáng)度, 以提高光生物反應(yīng)器的蝦青素產(chǎn)量。

然而, 光生物反應(yīng)器的蝦青素產(chǎn)量(脅迫7 d后,蝦青素產(chǎn)量為46.63 mg)卻顯著高于三角燒瓶(僅為0.87 mg)。日產(chǎn)蝦青素量前者(6.66 mg/d)為后者(6.21×10-2mg/d)的107倍。另一方面, 光生物反應(yīng)器的最佳脅迫周期其實(shí)僅為4 d(圖6), 而三角燒瓶卻需14 d。因此, 與三角燒瓶相比, 光生物反應(yīng)器更有利于雨生紅球藻的短周期、大體積培養(yǎng)。

2.3 接種密度對光生物反應(yīng)器中雨生紅球藻培養(yǎng)的影響

2.3.1 接種密度對光生物反應(yīng)器中藻細(xì)胞生長的影響

兩種接種密度(2.3×104個(gè)/mL 和 0.84×104個(gè)/mL)的藻細(xì)胞生長曲線如圖7所示。與后者(較低接種密度)相比, 前者藻細(xì)胞調(diào)整期較短(約1 d, 前者需3 d),因?yàn)榍罢咴谂囵B(yǎng)初期具有數(shù)量上的優(yōu)勢。培養(yǎng)7 d后,高接種密度的細(xì)胞已進(jìn)入穩(wěn)定期, 而低接種密度的細(xì)胞仍處于指數(shù)生長階段, 后者培養(yǎng)至第12天細(xì)胞密度才達(dá)到峰值(3.50×105個(gè)/mL), 但大于前者的最終細(xì)胞密度(3.04×105個(gè)/mL)。后者營養(yǎng)培養(yǎng)所需時(shí)間近似為前者的 2倍, 這表明較高的接種密度可能可以縮短營養(yǎng)培養(yǎng)周期。

圖8為不同接種密度藻細(xì)胞的每日生長速率。高接種密度的每日生長速率總體呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)第2～5天, 該值較穩(wěn)定(0.41～0.46 d-1), 細(xì)胞密度相應(yīng)平穩(wěn)增加。此后2 d內(nèi), 細(xì)胞每日生長速率急劇下降, 第7天藻密度達(dá)峰值, 為3.04×105個(gè)/mL。脅迫1 d后(第8天), 生長速率為負(fù)值, 即細(xì)胞不再生長。低接種密度細(xì)胞的每日生長速率出現(xiàn)兩次高潮(第4, 7天, 分別為0.48, 0.51 d-1), 均高于高接種密度的最大細(xì)胞每日生長速率(第4天, 0.46 d-1), 可見低接種密度條件下, 細(xì)胞生長后勁較足, 培養(yǎng)11 d后細(xì)胞最終密度可達(dá)3.53×105個(gè)/mL, 比高接種密度條件下高16%, 但達(dá)到細(xì)胞密度峰值所需時(shí)間比高接種密度條件多4 d。兩種接種密度的細(xì)胞平均生長速率分別為0.37, 0.34 d-1, 兩者差異較小。

表1 脅迫階段各指標(biāo)比較Tab. 1 Comparison of each index for Haematococcus pluvialis under stress in different device

圖7 光生物反應(yīng)器中不同接種密度下的細(xì)胞生長曲線圖Fig. 7 Growth curves of Haematococcus pluvialis with different cell inoculum densities in photobioreactor

圖8 光生物反應(yīng)器中不同接種密度的每日細(xì)胞生長速率Fig. 8 Daily growth rates of Haematococcus pluvialis with different cell inoculum densities in photobioreactor

總而言之, 兩種接種密度下細(xì)胞生長速率相當(dāng),盡管較高的接種密度具有較低的蝦青素積累量, 但卻有利于縮短培養(yǎng)周期, 工業(yè)生產(chǎn)中可望采用較高的接種密度以減少生產(chǎn)成本。

2.3.2 接種密度對光生物反應(yīng)器中蝦青素積累的影響

由圖9可知, 脅迫開始后, 蝦青素質(zhì)量濃度均穩(wěn)步升高, 總?cè)~綠素質(zhì)量濃度則都相應(yīng)下降。脅迫過程中, 高低接種密度下蝦青素的質(zhì)量濃度變化趨勢相近, 且均僅需 4 d即達(dá)蝦青素質(zhì)量濃度峰值(分別為10.08, 18.00 mg/L)。相同脅迫時(shí)間下, 低接種密度的蝦青素質(zhì)量濃度均高于高接種密度, 這是因?yàn)闋I養(yǎng)培養(yǎng)階段中前者具有較高的最終細(xì)胞密度(3.50×105個(gè)/mL)。

圖9 脅迫階段的蝦青素質(zhì)量濃度變化Fig. 9 The change of astaxanthin contents during stress stage

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用 NHL-Ⅲ型光生物反應(yīng)器大體積培養(yǎng)雨生紅球藻原始藻株。結(jié)果表明：

1) 反應(yīng)器中藻細(xì)胞的調(diào)整期較短, 接種 1 d后即進(jìn)入指數(shù)生長階段; 而在脅迫階段, 僅需4 d即達(dá)蝦青素的峰值; 同時(shí), 蝦青素日產(chǎn)量明顯高于傳統(tǒng)的三角燒瓶。說明光生物反應(yīng)器能使雨生紅球藻細(xì)胞獲得快速生長, 同時(shí)縮短脅迫周期, 可望降低工業(yè)生產(chǎn)成本。

2) 藻的生長是個(gè)產(chǎn)堿的過程, 但堿性過高則礙于其生長, 偏堿性條件(pH： 7.75±0.10)有利于藻細(xì)胞的生長?？傮w而言, 營養(yǎng)培養(yǎng)階段DO相對飽和度逐漸上升(可達(dá) 80%), 而在脅迫階段 DO則迅速降低,最低值小于6%, 其曲線變化與生長曲線基本相符。

3) 較低的接種密度(0.84×104個(gè)/mL)需較長的營養(yǎng)培養(yǎng)周期(11 d), 而較高的接種密度(2.3×104個(gè)/mL)則僅需7天, 此外, 接種密度高低對脅迫周期長短無影響(均為 4 d)。為縮短生產(chǎn)周期, 建議在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中考慮選用較高的接種密度。

[1] Kobayashi M, Okada T. Protective role of astaxanthin against uv-B irradiation in the green alga Haematococcus pluvialis[J]. Biotechnology Letters, 2000,22(3)： 177-181.

[2] Lorenz R T, Cysewski G R. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin[J]. Trends in Biotechnology, 2000, 18(4)：160-167.

[3] 蔡明剛, 王杉霖. 利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的研究進(jìn)展[J]. 臺(tái)灣海峽, 2003, 22(4)： 537-544.

[4] Lyons N M, O'Brien N M. Modulatory effects of an algal extract containing astaxanthin on UVA-irradiated cells in culture [J]. Journal of Dermatological Science,2002, 30(1)： 73-84.

[5] 蔡明剛, 王杉霖, 李文權(quán), 等. 天然蝦青素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 臺(tái)灣海峽, 2003, 22(3)：377-385.

[6] 張英, 蔡明剛, 齊安翔, 等. 維生素 B1, B12 在雨生紅球藻不同培養(yǎng)階段的作用研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 43(B08)： 142-146.

[7] Harker M, Tsavalos A J, Young A J. Autotrophic growth and carotenoid production of Haematococcus pluvialis in a 30 liter air-lift photobioreactor[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1996, 82(2)： 113-118.

[8] Choi S-L, Suh I S, Lee C-G. Lumostatic operation of bubble column photobioreactors for Haematococcus pluvialis cultures using a specific light uptake rate as a control parameter[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33(4)： 403-409.

[9] Kaewpintong K, Shotipruk A, Powtongsook S, et al.Photoautotrophic high-density cultivation of vegetative cells of Haematococcus pluvialis in airlift bioreactor[J].Bioresource Technology, 2006, 98(2)： 288-295.

[10] Ugwu C U, Aoyagi H, Uchiyama H. Photobioreactors for mass cultivation of algae[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(10)： 4021-4028.

[11] Benson B C, Gutierrez-Wing M T, Rusch K A. Optimization of the lighting system for a Hydraulically Integrated Serial Turbidostat Algal Reactor (HISTAR)：Economic implications[J]. Aquacultural Engineering,2009, 40(1)： 45-53.

[12] 魏東, 臧曉南. 大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素的研究進(jìn)展和產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀[J]. 中國海洋藥物, 2001,20(5)： 4-8.

[13] Lee H-S, Seo M-W, Kim Z H, et al. Determining the best specific light uptake rates for the lumostatic cultures in bubble column photobioreactors[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3)： 447-452.

[14] Lopez M C G-M, Sanchez E D R, Lopez J L C, et al.Comparative analysis of the outdoor culture of Haematococcus pluvialis in tubular and bubble column photobioreactors[J]. Journal of Biotechnology, 2006,123(3)： 329-342.

[15] Ranjbar R, Inoue R, Shiraishi H, et al. High efficiency production of astaxanthin by autotrophic cultivation of Haematococcus pluvialis in a bubble column photobioreactor[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008,106(2)： 204-207.

[16] Ranjbar R, Inoue R, Shiraishi H, et al. High efficiency production of astaxanthin by autotrophic cultivation of Haematococcus pluvialis in a bubble column photobioreactor[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008,39(3)： 575-580.

[17] Suh I S, Joo H-N, Lee C-G. A novel double-layered photobioreactor for simultaneous Haematococcus pluvialis cell growth and astaxanthin accumulation[J].Journal of Biotechnology, 2006, 125(4)： 540-546.

[18] Vega-Estrada J, Montes-Horcasitas M C, Dominguez-Bocanegra A R, et al. Haematococcus pluvialis cultivation in split-cylinder internal-loop airlift photobioreactor under aeration conditions avoiding cell damage[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2005,68(1)： 31-35.

[19] 劉偉, 劉建國, 林偉, 等. 雨生紅球藻規(guī)?；囵B(yǎng)工藝的構(gòu)建與應(yīng)用[J]. 飼料工業(yè), 2006, 27(12)： 12-17.

[20] 葉勇, 應(yīng)巧蘭. 用氣升式光生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)雨生紅球藻 797 株的初步研究[J]. 飼料工業(yè), 2003, 4(5)：11-13.

[21] 吳霞, 康瑞娟, 叢威, 等. 轉(zhuǎn)光膜在雨生紅球藻養(yǎng)殖上的應(yīng)用[J]. 過程工程學(xué)報(bào), 2006, 6(6)： 969-972.

[22] 邱保勝, 劉其芳. 雨生紅球藻 (Haematococcus pluvialis—6H) 培養(yǎng)條件研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1999, 33(1)： 112-118.

[23] 殷明焱, 劉建國, 張京浦. 雨生紅球藻和蝦青素研究評述[J]. 海洋湖沼通報(bào), 1998, 2： 53-62.

[24] Hagen C, Grünewald K, Xylander M, et al. Effect of cultivation parameters on growth and pigment biosynthesis in flagellated cells of Haematococcus pluvialis[J].Journal of Applied Phycology, 2001, 13(1)： 79-87.

[25] Kobayashi M, Kakizono T, Nagai S. Enhanced carotenoid biosynthesis by oxidative stress in acetate-induced cyst cells of a green unicellular alga, Haematococcus pluvialis[J]. Applied and Environmental Microbiol-ogy, 1993, 59(3)： 867-873.

[26] 李曉夢, 齊安翔, 蔡明剛, 等. 雨生紅球藻室外大體積培養(yǎng)與蝦青素積累初步研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 45(B05)： 245-249.

[27] 曹平華, 李曉霞, 禹學(xué)禮, 等. 雨生紅球藻在不同培養(yǎng)基中的生長效果比較[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 4：65-68.

[28] Sarada R, Tripathi U, Ravishankar G A. Influence of stress on astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under different culture conditions[J].Process Biochemistry, 2002, 37(6)： 623-627.

[29] 莊惠如, 陳文列. 雨生紅球藻 (Haematococcus pluvialis Flotow) 在脅迫條件下積累蝦青素過程的超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 電子顯微學(xué)報(bào), 2000, 19(2)： 137-142.

Haematococcus pluvialis culture in photobioreactor

SHEN Yuan1, CAI Ming-gang1,2, HUANG Shui-ying1, SHI Rong-gui1, LI Zhe1, LU Xiao-xia1
(1. College of Oceanography and Environmental Science, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2. Key Labotary of Marine Chemisty and Applying Technology of Fujian Province, Xiamen 361005, China)

Mar., 7, 2009

Haematococcus pluvialis; astaxanthin; photobioreactor; culture; accumulation

The green microalga Haematococcus pluvialis was cultured in photobioreactor and light incubator, respectively, to compare the effect on cell growth and astaxanthin accumulation. The effects of pH, dissolved oxygen(DO), and effects of different inoculating densities were also studied. The results indicated that only one day was needed for algae in photobioreactor to enter exponential growth phase and only four days were required to reach the maximum of astaxanthin content during stress stage. The culture period of algae in photobioreactor was shorter than that in light incubator. Slight alkaline condition (pH =7.75 ±0.10) was beneficial to the cell growth. DO increased up to 80% during nutrient culture stage and decreased rapidly during stress stage with a minimum of less than 6%.Since the higher cell inoculum density (2.3×104cell/mL) showed shorter nutrient culture period (7 days) and different cell inoculum densities had no effect on the length of stress period (only 4 days were needed), we suggested that higher cell inoculum density might be adopted for reducing costs and shorten cycles of algae production.

Q935

A

1000-3096(2010)10-0083-07

2009-03-07;

2010-07-06

廈門市科技項(xiàng)目(3052Z20031086); 新加坡廈門大學(xué)校友基金會(huì)項(xiàng)目(2007); 2007年度國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2007);第十一屆“挑戰(zhàn)杯”全國大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽(2009); 廈門大學(xué)海洋學(xué)系“海洋”本科生科研獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃(2008)

沈淵(1986-), 男, 福建詔安人, 廈門大學(xué)在讀本科生; 蔡明剛(1974-), 通信作者, 男, 福建廈門人, 副教授, 主要從事微藻天然產(chǎn)物化學(xué)等領(lǐng)域的開發(fā)與研究, E-mail： mgcai@xmu.edu.cn

(本文編輯： 劉珊珊)