水產(chǎn)動物致病性副溶血弧菌雙重PCR檢測方法的研究

張曉君, 梁利國, 閻斌倫, 秦 蕾, 戚耀之

(淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室, 江蘇 連云港 222005)

水產(chǎn)動物致病性副溶血弧菌雙重PCR檢測方法的研究

張曉君, 梁利國, 閻斌倫, 秦 蕾, 戚耀之

(淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室, 江蘇 連云港 222005)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的主要病原菌, 尤其是可引起凡納濱對蝦幼蝦呈毀滅性死亡。本研究基于gyrB和toxR兩種基因序列設(shè)計2對特異性引物, 建立一種副溶血弧菌快速、準(zhǔn)確的雙重PCR檢測方法, 擴增目的片段大小分別為285 bp和368 bp。結(jié)果表明在同一PCR反應(yīng)體系中副溶血弧菌可同時擴增大小分別為285 bp和368 bp的2種基因片段, 兩種引物對4種其他水產(chǎn)動物病原菌無交叉反應(yīng); 敏感性檢測結(jié)果顯示, 該雙重 PCR最低能檢測 8.867 2×103CFU/mL菌體濃度的副溶血弧菌, 對副溶血弧菌模板DNA的檢出極限為0.029 3 mg/L; 對發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體、水產(chǎn)品及蝦池養(yǎng)殖用水進(jìn)行雙重PCR檢測, 呈陽性反應(yīng)的樣品可分離出優(yōu)勢生長的副溶血弧菌。該實驗所建立的基于gyrB和toxR兩種基因的雙重PCR檢測方法可用于副溶血弧菌引起的水產(chǎn)動物疾病的快速診斷及分子流行病學(xué)的調(diào)查研究。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus); gyrB基因; toxR基因; 雙重PCR

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)廣泛存在于世界各地近海岸的海水、海底沉積物及海生動物中, 該菌最早是于1950年藤野從日本大阪市發(fā)生的食物中毒病例分離, 之后世界許多國家如日本、中國、澳大利亞、印度、美國、越南、泰國、多哥、馬來西亞、新加坡、俄羅斯、巴拿馬、新西蘭、羅馬尼亞、墨西哥等均陸續(xù)報告了副溶血弧菌食物中毒或腸炎, 以日本和我國分布最廣、發(fā)病率最高, 該菌主要通過食物傳播, 最主要的是生食海產(chǎn)品, 此外, 該菌可引起多種水產(chǎn)動物(魚、蝦、蟹、貝等)的感染發(fā)病, 是一種人與水產(chǎn)養(yǎng)殖動物共染的病原菌。副溶血弧菌尤其是對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)危害嚴(yán)重[1～3], 近年來多次引起江蘇贛榆縣養(yǎng)殖凡納濱對蝦幼蝦發(fā)生毀滅性死亡[4]。

副溶血弧菌傳統(tǒng)的檢驗方法包括形態(tài)學(xué)檢測、生理生化特征檢測和血清學(xué)鑒定等, 這些檢測手段不僅工作量大, 而且耗時長, 已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上的診斷要求。因此選擇合適的分子靶標(biāo), 研究開發(fā)靈敏度高、特異性強的病原副溶血弧菌快速檢測方法已十分重要, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物處于帶菌狀態(tài)或大規(guī)模爆發(fā)細(xì)菌性疾病之前能進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測, 這是傳統(tǒng)方法無法比擬的。尤其是多種不同基因綜合檢測以進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性和特異性, 將為副溶血弧菌引起的水產(chǎn)動物疾病的監(jiān)測及其控制奠定良好的基礎(chǔ)。gyrB基因編碼的是唯一一種能誘導(dǎo) DNA負(fù)超螺旋的拓?fù)洚悩?gòu)酶—DNA促旋酶的 B亞單位蛋白, Yamamoto等1995年設(shè)計出通用引物可從許多革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌成功擴增出gyrB基因, 特別適合作為分子靶標(biāo)進(jìn)行細(xì)菌種間鑒別[5], gyrB 基因是副溶血弧菌DNA復(fù)制所必需的, 具有副溶血弧菌種特異性, 而且為單拷貝基因, 具設(shè)計 PCR引物的保守區(qū)域[6]。toxR基因廣泛分布于弧菌科細(xì)菌, 該基因最先是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)[7], 由它編碼的跨膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白 toxR參與調(diào)控霍亂弧菌的一些主要毒力基因和外膜蛋白的表達(dá)[8]。目前 toxR基因已在副溶血弧菌[9]、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)[10]、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)[11]等很多弧菌中發(fā)現(xiàn), 同時異種之間的toxR基因核苷酸序列相似性較低, 是弧菌科種間鑒定的良好分子靶標(biāo), toxR基因可在種的水平上檢測副溶血弧菌。作者報告了以編碼gyrB和編碼toxR的兩種基因為靶基因建立了快速檢測病原副溶血弧菌的雙重PCR方法, 通過特異性試驗、敏感度試驗、應(yīng)用性試驗證實該方法特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測耗時短, 是快速檢測副溶血弧菌的有效方法, 以期為相應(yīng)疾病的診斷及流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

供試副溶血弧菌分離自江蘇連云港贛榆縣發(fā)病凡納濱對蝦幼蝦, 供試對照鰻弧菌(Vibrio anguil-larum)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、美人魚發(fā)光桿菌即美人魚弧菌(Vibrio damsela)及愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)均分離自海水魚, 已通過表型及分子鑒定[12～15], 本實驗室保存供用, 菌株編號及在GenBank 登錄號見表1。

表1 供試菌株及其來源Tab. 1 Origin and species of tested bacteria

1.2 細(xì)菌模板DNA的制備

試驗所需細(xì)菌模板DNA按細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒及煮沸兩種方法提取。細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒法： 取純培養(yǎng)菌分別接種于含鹽 1%的 LB肉湯中28℃培養(yǎng)16 h, 按上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒所述方法提取DNA, 作為PCR模板。煮沸法： 取1 mL菌液離心1 min(12 000 r/min), 棄上清, 將菌體懸浮于100 μL的滅菌蒸餾水中, 100℃煮沸10 min, 冰浴中冷卻后離心10 min(12 000 r/min), 取上清作為PCR模板。

1.3 引物設(shè)計與合成

以gyrB基因為靶基因設(shè)計副溶血弧菌的特異性檢測引物： VP-1： CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT;VP-2r： TCCGCTTCGCGCTCATCAATA[6]。以toxR基因為靶基因設(shè)計副溶血弧菌的特異性檢測引物：vp-toxR-F： GTCTTCTGACGCAATCGTTG; vp-toxRR： ATACGAGTGGTTGCTGTCATG[16]。兩對引物均由上海生物工程技術(shù)公司合成。

1.4 PCR各反應(yīng)條件的優(yōu)化及電泳分析

以gyrB和toxR兩種基因設(shè)計的引物分別對模板進(jìn)行單一擴增; 在同一次 PCR反應(yīng)中, 應(yīng)用同一個PCR反應(yīng)程序, 用上述兩種引物同步對模板進(jìn)行擴增。對PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化, 篩選出單一PCR及雙重PCR反應(yīng)中最佳反應(yīng)模式。

PCR擴增后的產(chǎn)物, 用1.2%瓊脂糖凝膠在80V電壓下電泳 45 min, 用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.5 雙重PCR反應(yīng)的特異性檢測

以鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌及愛德華氏菌為對照菌株, 按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行 PCR擴增, 分別進(jìn)行上述2對引物雙重PCR的特異性檢驗。對陽性結(jié)果進(jìn)行不加模板和不加引物的陰性對照檢測。

1.6 PCR反應(yīng)的靈敏性檢測

分別從菌液稀釋以及模板DNA稀釋兩方面來檢測方法的靈敏性。

菌液稀釋： 將濃度約為 4.54×108CFU/mL 的副溶血弧菌培養(yǎng)物, 用滅菌雙蒸水進(jìn)行系列稀釋(前 3管為10倍稀釋, 第4至第13管為2倍稀釋), 菌液稀釋為(保留小數(shù)點后 4 位)： 4.54×108、4.54×107、4.54×106、2.27×106, 1.135×106, 5.675×105, 2.837 5×105, 1.418 8×105, 7.093 8×104, 3.546 9×104, 1.773 4×104, 8.867 2×103, 4.433 6×103CFU/mL, 共 13 個稀釋倍數(shù), 按1.2所述煮沸法, 取1 mL菌液提取DNA作為PCR模板進(jìn)行檢測。同時進(jìn)行不加模板和不加引物的陰性對照檢測。

模板DNA稀釋： 小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取的副溶血弧菌基因組DNA, 從60 mg/L起2倍連續(xù)稀釋為： 60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 8、0.234 4、0.117 2、0.058 6、0.029 3、0.014 6 mg/L, 共 13個稀釋倍數(shù), 按上述方法進(jìn)行 PCR檢測。同時進(jìn)行不加模板和不加引物的陰性對照檢測。

1.7 雙重PCR檢測的應(yīng)用

取連云港贛榆縣育苗場發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體及養(yǎng)殖用水, 采取市場水產(chǎn)品(扇貝、雜色蛤、縊蟶、中國對蝦、玉螺、毛蚶)并勻漿, 均用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h, 增菌液煮沸法提取DNA并進(jìn)行PCR擴增。PCR檢測陽性樣品按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌分離及表型與分子檢測。

2 結(jié)果

2.1 單一及雙重PCR檢測方法的確定

通過對不同反應(yīng)條件下 DNA擴增結(jié)果的比較,確定了副溶血弧菌的最佳PCR模式。

以gyrB基因為靶基因檢測 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min, 接 94℃變性 20 s、52℃復(fù)性 20 s、72℃延伸15 s、35個循環(huán), 然后72℃溫育5 min; 在20 μL 反應(yīng)體系中含有： 水 13.4 μL, 10×PCR 緩沖液2 μL, MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL, 4×dNTP 混合物0.4 μL, 引物各 0.2 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL, 模板 DNA 2 μL。

以toxR基因為靶基因檢測 PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3 min, 接 94℃變性 1 min、58℃復(fù)性1 min、72℃延伸1 min、30個循環(huán), 然后72℃溫育7 min; 在20 μL反應(yīng)體系中含有： 水 13.4 μL, 10×PCR緩沖液 2 μL, MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL, 4×dNTP 混合物 0.4 μL, 引物各 0.2 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL, 模板 DNA 2 μL。

以gyrB和toxR基因為靶基因同步檢測的PCR反應(yīng)條件為： 94℃預(yù)變性3 min, 接94℃變性1 min、57℃復(fù)性1 min、72℃延伸1 min、30個循環(huán), 然后72℃溫育 7 min。在 40 μL反應(yīng)體系中含有： 水 28.6 μL,10×PCR 緩沖液 4 μL, MgCl2(25 mmol/L)3.2 μL,4×dNTP 混合物 0.8 μL, 引物各 0.5 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL, 模板 DNA 2 μL。

2.2 單一及雙重PCR特異性擴增結(jié)果

應(yīng)用上述程序?qū)Ω比苎【推渌Ｋ~類病原菌基因組DNA(細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取)分別進(jìn)行單一及雙重 PCR 擴增, 結(jié)果以gyrB基因為靶基因擴增, 副溶血弧菌株只擴增出285 bp一條帶; 以toxR基因為靶基因擴增, 副溶血弧菌株只擴增出368 bp一條帶; 以gyrB和toxR基因為靶基因同步擴增, 副溶血弧菌株擴增出285 bp和368 bp二條帶, 而其他4種海水魚類病原菌(鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌及愛德華氏菌)均未出現(xiàn)任何擴增條帶(圖1)。表明本實驗建立的副溶血弧菌PCR檢測方法具有很強的特異性。

圖1 副溶血弧菌單一及雙重PCR特異性試驗檢測結(jié)果Fig. 1 Specificity of single-dulplex PCR for detection of V.parahaemolyticusM. DL2000; 1.gyrB基因擴增片段; 2.toxR基因擴增片段; 3. gyrB和toxR基因同步擴增片段; 4～7. 4種病原弧菌對照M. DL2000; 1. amplified fragment of gyrB; 2. amplified fragment of toxR; 3. simultaneous amplified fragments of gyrB and toxR; 4～7.control of four pathogenic Vibrio sp.

2.3 菌液稀釋雙重PCR檢測的靈敏度

10倍系列稀釋菌液按 1.2所述方法煮沸提取DNA, 按2.1優(yōu)化出的雙重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測,結(jié)果表明在40 μL反應(yīng)體系中, 模板DNA加入2 μL,菌 體 濃 度 自 4.54×108CFU/mL 至 1.773 4×104CFU/mL均可擴增出清晰條帶, 菌體濃度為8.867 2×103CFU/mL擴增條帶較暗, 菌體濃度為4.433 6×103CFU/mL未擴增出條帶(圖 2), 表明本實驗建立的雙重PCR方法檢測副溶血弧菌菌體靈敏度為8.867 2×103CFU/mL。

圖2 副溶血弧菌菌液稀釋法雙重PCR敏感性檢測結(jié)果Fig. 2 Sensitivity of dulplex PCR for detection of V. parahaemolyticus dilutionM.DL2000; 1～13.雙重 PCR 擴增片段(菌液系列稀釋： 依次為4.54×108～4.4336×103CFU/mL)M. DL2000; 1～13. amplified fragments of dulplex PCR (V. parahaemolyticus serially diluted from 4.54×108～4.4336×103 CFU/mL)

2.4 模板 DNA稀釋雙重 PCR檢測的靈敏度

細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取的DNA 2倍系列稀釋后作模板, 按2.1優(yōu)化出的雙重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測, 結(jié)果表明在 40 μL反應(yīng)體系中, 模板DNA 加入 2 μL(質(zhì)量濃度 60～0.014 6 mg/ L), 副溶血弧菌基因組DNA質(zhì)量濃度在60～0.1172 mg/L 的范圍均可擴增出明亮條帶, 基因組 DNA質(zhì)量濃度在0.058 6 mg/L 和0.029 3 mg/L 擴增條帶較暗淡, 基因組DNA質(zhì)量濃度在0.014 6 mg/L 無擴增條帶(圖3), 表明本實驗建立的雙重 PCR方法對副溶血弧菌模板DNA的檢出靈敏度為0.029 3 mg/L 。

圖3 副溶血弧菌模板DNA稀釋法雙重PCR敏感性檢測結(jié)果Fig. 3 Sensitivity of dulplex PCR for detection of V. parahaemolyticus dilutionM. DL2000; 1～13.雙重PCR擴增片段(模板DNA 2倍系列稀釋：依次為60～0.014 6 mg/L)M. DL2000; 1～13. amplified fragments of dulplex PCR (purified chromosomal DNA of V. parahaemolyticus serially diluted 2-fold from 60～0.014 6 mg/L)

2.5 雙重PCR檢測病蝦及水產(chǎn)品的實驗結(jié)果

對發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體、水產(chǎn)品及蝦池養(yǎng)殖用水進(jìn)行副溶血弧菌雙重 PCR檢測, 共 8份樣品,其中發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體檢測結(jié)果為陽性, 其余均為陰性(圖 4)。陽性樣品(發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體)經(jīng)細(xì)菌分離、形態(tài)及理化特性等表型生物學(xué)特性、16S rRNA與gyrB基因的分子檢測, 表明分離自發(fā)病中國對蝦糠蝦幼體的優(yōu)勢生長菌為弧菌屬的副溶血弧菌。

3 討論

傳統(tǒng)的副溶血弧菌檢測方法需做分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)及多項生理生化特征檢驗, 方法繁瑣、耗時長,不能滿足快速、準(zhǔn)確檢測的現(xiàn)實需要。由于副溶血弧菌具有多種表型、血清型[17]和產(chǎn)毒型菌株[18,19],因此針對溶血素設(shè)計的引物和探針不能同時檢測所有的致病性菌株[20,21], 本試驗是根據(jù)副溶血弧菌的gyrB和toxR兩種基因序列設(shè)計2對特異性引物, 通過進(jìn)行雙重 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化, 雙重PCR的特異性和敏感性實驗, 建立了一種副溶血弧菌快速、準(zhǔn)確的雙重 PCR檢測方法, 以進(jìn)一步提高檢測的準(zhǔn)確性和特異性。

圖4 糠蝦幼體及水產(chǎn)品的雙重PCR檢測結(jié)果Fig. 4 Results of dulplex PCR for detection of V. parahaemolyticus from diseased shrimps and aquatic productsM.DL2000; 1.毛蚶; 2.扇貝; 3.糠蝦幼體; 4.雜色蛤; 5.縊蟶; 6.中國對蝦; 7.玉螺; 8.養(yǎng)殖用水; 9.未增菌糠蝦幼體M.DL2000; 1. Scapharca subcrenata; 2. Argopectens irradias;3. mysis; 4. Ruditapes philippinarum; 5. Sinonovacula constricta;6. Fenneropenaeus chinensis; 7. Neverita; 8. agricultural water;9. bacterial no-enrichment mysis

多重PCR的反應(yīng)條件將顯著影響反應(yīng)的可行性,在該雙重 PCR反應(yīng)體系中, 兩個 PCR片段分別為285bp和368bp, 通過對引物用量和PCR擴增條件優(yōu)化, 二種引物的最佳工作濃度為0.125 mmol/L, 最佳退火溫度為57℃。說明了要使多重PCR反應(yīng)體系中每一目的片段都得到最佳擴增結(jié)果, 適當(dāng)?shù)囊餄舛仁鞘种匾? PCR最重要的循環(huán)參數(shù)是退火溫度, 退火溫度即使有輕微的變化也會影響多重 PCR反應(yīng)的效果, 本實驗在退火溫度為58℃時, 285 bp條帶擴增不出, 退火溫度為56.5℃時, 368 bp條帶擴增不出, 退火溫度為57℃時, 2條目的基因擴增條帶均較為清晰,多重PCR擴增效率最佳。

單一及雙重 PCR的特異性試驗結(jié)果表明, 僅對所檢測的副溶血弧菌可擴增出大小分別為285 bp和368 bp的 2個基因片段, 對水產(chǎn)動物其他病原細(xì)菌(鰻弧菌、哈氏弧菌、美人魚弧菌及愛德華氏菌)的檢測均呈陰性反應(yīng), 說明設(shè)計的引物對病原副溶血弧菌具有良好的特異性, 該方法可用于副溶血弧菌引起的疾病的診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。

本實驗從菌體濃度及DNA濃度兩方面進(jìn)行了雙重 PCR靈敏度檢測, 結(jié)果顯示, 該試驗所設(shè)計的 2對特異性引物及PCR檢測方法對病原副溶血弧菌的菌體濃度檢出極限為 8.867 2×103CFU/mL, 對模板DNA的檢測靈敏度為0.029 3 mg/L, 結(jié)果顯示兩方面的檢測結(jié)果有一定差異, 可能原因是, 菌體濃度計算采用菌落計數(shù)方法, 該方法菌體計數(shù)具有一定誤差。有關(guān)水產(chǎn)動物病原細(xì)菌PCR靈敏度檢測已多有記述, 余俊紅等[22]報道用PCR方法檢測花鱸感染鰻弧菌的靈敏度為5×10-4mg/L, 張鳳萍等[23]報道用PCR方法檢測刺參腐皮綜合征病原燦爛的靈敏度為0.5 μg/L, 繞靜靜等[24]報道用多重 PCR檢測致病性嗜水氣單胞菌靈敏度為 10 mg/L , 本試驗建立的雙重 PCR方法, 其靈敏度能夠滿足臨床副溶血弧菌株檢測的需要。

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Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus isolated from aquatic animals by dulplex PCR

ZHANG Xiao-jun, LIANG Li-guo, YAN Bin-lun, QIN Lei, QI Yao-zhi
(College of Ocean, Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005, China)

Dec., 4, 2009

Vibrio parahaemolyticus; gyrB gene; toxR gene; dulplex PCR

V. parahaemolyticus is a significant pathogen for the aquaculture industry, particularly devastating impact on cultivated Litopenaeus vannamei. In this study, two pair of specific primers was designed that allowed amplification of 285 bp and 368bp gene fragments based on gyrB and toxR genes. A simple dulplex polymerase chain reaction (PCR) that will detect V. parahaemolyticus were established. Consequently, two PCR primers could simultaneously amplify 285 bp and 368bp gene fragments from chromosomal DNA of V. parahaemolyticus in one PCR reaction, and no cross reaction was detected in 4 other pathogenic Vibrio species tested. The results of sensitivity of dulplex PCR showed that the two primers could detect V. parahaemolyticus at a level of as few as 8.8672×103CFU/mL, and detect purified chromosomal DNA at a level of as few as 0.0293 mg/L . Dominant V.parahaemolyticus could be isolated from the positive sample of dulplex PCR through detecting mysis, aquatic products and tank water samples. The PCR protocol amplifying gyrB and toxR gene fragments of the V. parahaemolyticus was established and could be useful in the specific and rapid diagnose of the disease caused by V.parahaemolyticus.

S941

A

1000-3096(2010)10-0007-06

2009-12-04;

2010-01-11

江蘇省水產(chǎn)三項工程項目(PJ2010-58); 江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2009163); 淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室研究基金項目(2008HS016)

張曉君(1969-), 河北秦皇島人, 教授, 博士, 電話：0518-85895251, E-mail： zxj9307@163.com

(本文編輯： 梁德海)