劉 鵬，王澤南*，蘇 婭，李 瑩，張秋子，吳紅引

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的篩選與鑒定

劉 鵬，王澤南*，蘇 婭，李 瑩，張秋子，吳紅引

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

利用含有300g/L葡萄糖的高滲培養(yǎng)基從蜂蜜、花粉、土壤等樣品中篩選耐高滲酵母菌，經(jīng)薄層層析和高效液相色譜分析得到兩株產(chǎn)赤蘚糖醇且不產(chǎn)甘油的酵母菌，通過高碘酸氧化法篩選出其中赤蘚糖醇產(chǎn)量較高的一株菌株E54。菌株E54在含葡萄糖200g/L、酵母膏5g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵90h，赤蘚糖醇產(chǎn)量為41.1g/L，轉(zhuǎn)化率為22.8%。通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、5.8S rDNA序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，初步鑒定E54為Moniliella acetoabutans(叢梗孢酵母)。

赤蘚糖醇；篩選；鑒定；叢梗孢屬；系統(tǒng)進(jìn)化樹

Abstract：Osmophilic yeasts were isolated from honey, pollen and soil by using the medium containing 30% glucose. Two strains producing erythritol but not producing glycerol were identified by thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Strain E54 with high ability to produce erythritol was selected by periodic acid oxidation method.The productivity and conversion rate of erythritol were 41.1 g/L and 22.8% after fermentation for 90 h using strain E54 in the medium containing 20% glucose and 0.5% yeast extract. This strain was identified asMoniliella acetoabutansthrough the analyses of morphological, physiological and biochemical characteristics, 5.8S rDNA sequence and the established phylogenetic tree.

Key words：erythritol；screening；identification；Moniliella；phylogenetic tree

赤蘚糖醇是一種新型甜味劑，它有著熱量值很低、耐受量高、非致齲齒特性[1]、抗氧化活性[2]等優(yōu)良特性。因此，赤蘚糖醇越來越受到人們的關(guān)注，其生產(chǎn)能力和市場規(guī)模正日益擴(kuò)大。

赤蘚糖醇在工業(yè)上主要由微生物發(fā)酵而得，國外在產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的選育方面研究較早[1]。1957年Spencer等[3]發(fā)現(xiàn)一些耐高滲酵母可以產(chǎn)甘油、赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇。1964年Hajny等[4]篩選到一株產(chǎn)赤蘚糖醇Torulopsis屬酵母。1989年Ishizuka等[5]篩選到菌株Aureoasidiumsp. SN-115。其后篩選到的產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株有Trichosporon屬[6]、Candida屬[7]、Moniliella屬[8]等。我國對赤蘚糖醇的研究起步較晚，公開報道的有南京化工大學(xué)的徐虹等[9]篩選到一株耐高滲酵母T-9，江南大學(xué)的范光先等[10]篩選出一株球擬酵母OS-194，江蘇微生物研究所的吳燕等[11]篩選到一株圓酵母B845，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)的葉嫻等[12]篩選出一株球擬酵母K-23。目前日本、韓國等國對赤蘚糖醇的開發(fā)利用較多，用于商業(yè)的主要是日本Aureobasidiumsp.變異株和韓國的Candida magnoliae[13]。國內(nèi)篩選的菌株大都還停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，產(chǎn)量較低，因此篩選出赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株顯得極為必要。本研究從花粉、蜂蜜、土壤等樣品中篩選赤蘚糖醇高產(chǎn)株，并對其進(jìn)行鑒定，為后續(xù)的菌種改良以及赤蘚糖醇工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤、蜂蜜和花粉采集于合肥周邊果園和蜂場。

葡萄糖、赤蘚糖醇、聯(lián)苯胺、高碘酸鈉、變色酸、丙酮、氯化亞錫等均為分析純；瓊脂粉、酵母膏等為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；液相色譜工作站 美國Waters公司；JSM-6700F掃描電子顯微鏡 日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

富集培養(yǎng)基：葡萄糖300g/L、酵母膏5g/L；平板和斜面培養(yǎng)基：葡萄糖200g/L、酵母膏5g/L、瓊脂30g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖200g/L、酵母膏5g/L[8]。

富集培養(yǎng)：在裝液量為20%、30℃、180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)3d；平板培養(yǎng)：在恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2d；斜面培養(yǎng)：在恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2d后冰箱保藏；搖瓶發(fā)酵：在裝液量為10%、30℃、180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)90h[14]。

1.3.2 產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的初篩

將樣品稀釋后富集培養(yǎng)，用高滲平板篩選出耐高滲酵母。將篩選出來的耐高滲酵母搖瓶培養(yǎng)48h，用薄層層析法[15]初步鑒定發(fā)酵液中是否含有赤蘚糖醇，再通過高效液相色譜做進(jìn)一步的確定。

薄層層析展開劑為正丁醇-乙酸-水，體積比4:1:1；顯色液A(0.1%高碘酸鈉溶液)；顯色液B(2.8g聯(lián)苯胺溶于80mL 95%乙醇，70mL蒸餾水，30mL丙酮，1.5mL鹽酸，靜置12h備用)。

高效液相色譜法：色譜柱為Cosmosil Sugar-D糖柱(4.6mm×250mm，5μm)；洗脫劑為乙腈、水(體積比80:20)；流速1.0mL/min；柱溫30℃；Waters 515泵；檢測器為Waters 2420檢測器(ELSD，蒸發(fā)光檢測器)；增益值(gain) 100；氣壓25psi；漂移管溫度(tube temp)55℃；噴霧器級別60%。

1.3.3 產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的復(fù)篩

發(fā)酵液中赤蘚糖醇含量的測定方法為高碘酸氧化法，殘?zhí)堑臏y定方法為3,5-二硝基水楊酸法。復(fù)篩以赤蘚糖醇含量和轉(zhuǎn)化率為依據(jù)，篩選出發(fā)酵性能較優(yōu)菌株。

高碘酸氧化法：參見文獻(xiàn)[16]。3,5-二硝基水楊酸法：參見文獻(xiàn)[17]。

1.3.4 菌株鑒定

細(xì)胞形態(tài)觀察：將試管斜面中的菌落制成菌懸液，經(jīng)過清洗、固定、脫水、干燥、鍍金后，用掃描電鏡觀察[18]。菌落形態(tài)的觀察：參見文獻(xiàn)[14]。生理生化實(shí)驗(yàn)：參見文獻(xiàn)[19]。5.8S rDNA序列測定：交由上海生物工程有限公司測定。系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析：軟件MEGA4.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的初篩

2.1.1 發(fā)酵液薄層層析結(jié)果

赤蘚糖醇的Rf值約為0.25，展開斑點(diǎn)為白色，甘油Rf值約為0.35，展開斑點(diǎn)為黃色，兩者分離效果和重現(xiàn)性都很好。從樣品中篩選出4株產(chǎn)赤蘚糖醇菌株E21、E28、E51和E54，其薄層層析結(jié)果見表1。

表1 薄層層析結(jié)果Table 1 Results of thin layer chromatographic separation of fermentation broths of four selected strains

由于菌株E51和E54在層析板上的赤蘚糖醇斑點(diǎn)較大且沒有甘油斑點(diǎn)，說明其赤蘚糖醇含量較高，且沒有副產(chǎn)物甘油。因此選擇菌株E51和E54通過高效液相色譜做進(jìn)一步的確定。

2.1.2 發(fā)酵液高效液相圖譜

將菌株E51和E54的48h發(fā)酵液稀釋后通過高效液相色譜做進(jìn)一步的判定，其高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜結(jié)果Fig.1 HPLC profiles of erythritol and glycerol standards and fermentation broths of strains E51 and E54

由圖1a和b可以看出赤蘚糖醇的保留時間約為6.8min，甘油的保留時間約為5.5min。由圖1c和d可知菌株E51和E54的發(fā)酵液中含有赤蘚糖醇，不含甘油。其與薄層層析所得結(jié)果一致。因此，選擇菌株E51和E54做進(jìn)一步的篩選。

2.2 產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的復(fù)篩

將菌株E51和E54搖瓶發(fā)酵90h后測定發(fā)酵液中赤蘚糖醇和殘?zhí)呛?，取平均值，測定結(jié)果見表2。

表2 菌株E51和E54發(fā)酵結(jié)果(n=3)Table 2 Comparative fermentation results obtained using strains E51 and E54 (n=3)

從表2可以看出，菌株E54發(fā)酵性能穩(wěn)定，發(fā)酵90h后赤蘚糖醇含量達(dá)到41.1g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了22.8%，均比E51要高。國內(nèi)篩選的原始菌株中產(chǎn)量較高的K-23[12]發(fā)酵144h后赤蘚糖醇產(chǎn)量為46.8g/L，轉(zhuǎn)化率為23.4%，E54與之相比發(fā)酵時間相對較短的情況下，產(chǎn)量處于較高水平。因此選擇菌株E54作為赤蘚糖醇的生產(chǎn)菌株。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 E54細(xì)胞形態(tài)和菌落形態(tài)

圖2a顯示E54細(xì)胞為不規(guī)則球形、橢圓形，直徑約為4～5μm，出芽生殖，呈串狀排列，較老細(xì)胞表面散布著一些凸出物。圖2b顯示E54菌落形態(tài)較干，白色不透明，不光滑，表面有皺褶，邊緣不規(guī)整。根據(jù)文獻(xiàn)[8]和[19]，通過觀察發(fā)現(xiàn)菌株E54的細(xì)胞和菌落形態(tài)與Moniliella屬、Trichosporon屬、以及Candida屬較為接近。

圖2 菌株E54的細(xì)胞形態(tài)和菌落形態(tài)Fig.2 Morphology and colony of strain E54

2.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

表3 菌株E54的生理生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與比較Table 3 Comparisons of physiological and biochemical properties of strain E54,Moniliella,TrichosporonandCandida

如表3所示，菌株E54的一些關(guān)鍵生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Moniliella屬一致，而與Trichosporon屬有明顯的不同，與Candida屬無法判斷。

2.3.3 5.8S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株E54的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain E54

克隆所得的E54的5.8S rDNA序列全長為440bp，將結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源系列搜索。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載相似性較高的酵母菌菌種的相關(guān)序列進(jìn)行分析。采用Neighbor-Joining法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，篩選菌株E54和Moniliella acetoabutans(EU252153.1)的遺傳距離最近，且核苷酸序列同源性達(dá)到了98%，因此可以認(rèn)為E54屬于Moniliella acetoabutans(叢梗孢酵母)。

3 結(jié) 論

經(jīng)高滲培養(yǎng)基的篩選及薄層層析和高效液相色譜的分析，從花粉中篩選到產(chǎn)赤蘚糖醇不產(chǎn)甘油的菌株E51和E54。由高碘酸氧化法復(fù)篩得到高產(chǎn)株E54。菌株E54在含葡萄糖200g/L、酵母膏5g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)90h后，赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到41.1g/L，轉(zhuǎn)化率為22.8%。其在發(fā)酵時間相對較短的情況下赤蘚糖醇的產(chǎn)量處于較高的水平，是一株較好的生產(chǎn)菌株。

細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示菌株E54與Moniliella屬酵母菌一致，5.8S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株E 54和Moniliella acetoabutans(EU252153.1)最為接近，因此可以初步鑒定E54屬于Moniliella acetoabutans(叢梗孢酵母)。

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Screening and Identification of Erythritol-producing Strains

LIU Peng，WANG Ze-nan*，SU Ya，LI Ying，ZHANG Qiu-zi，WU Hong-yin
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Q93.331

A

1002-6630(2010)21-0308-04

2010-07-19

安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(Kj2010A276)

劉鵬(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镔Y源綜合利用。E-mail：liupeng2244@gmail.com

*通信作者：王澤南(1947—)，男，教授，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：wznan@ah163.com