響應(yīng)面法優(yōu)化鏈霉菌HD-010發(fā)酵產(chǎn)抗辣椒根腐病菌活性物質(zhì)條件

張海秀，杜春梅*

(1.哈爾濱學(xué)院理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

響應(yīng)面法優(yōu)化鏈霉菌HD-010發(fā)酵產(chǎn)抗辣椒根腐病菌活性物質(zhì)條件

張海秀1，杜春梅2,*

(1.哈爾濱學(xué)院理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

用Plackett-Burman和中心復(fù)合(central composite design)試驗設(shè)計對影響拮抗鏈霉菌HD-010菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗辣椒根腐病菌活性物質(zhì)的9個因素進(jìn)行篩選優(yōu)化。結(jié)果表明：葡萄糖、蔗糖、玉米粉是發(fā)酵培養(yǎng)基中影響抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的主要因素。以發(fā)酵液效價值為響應(yīng)值，對3個因素進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計，并經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到影響抗菌活性物質(zhì)效價值的二階模型，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基3個關(guān)鍵因素的水平為：葡萄糖質(zhì)量濃度10g/L，蔗糖質(zhì)量濃度10.2g/L，玉米粉質(zhì)量濃度25.8g/L，采用此優(yōu)化配方，發(fā)酵液效價值比原始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液提高了55.28%，為進(jìn)一步生產(chǎn)提供參考。

鏈霉菌HD-010；發(fā)酵；響應(yīng)面優(yōu)化

Abstract：In this study, anti-Fusarium solonisubstances were produced by means ofStreptomycesHD-010 fermentation. In order to maximize anti-Fusarium solonipotency, Plackett-Burman (PB) experimental design was initially used to screen the most important affecting factors out of nine ones including medium components and fermentation conditions, followed by central composition design based response surface optimization of three screened factors. Glucose, sucrose and corn flour concentrations in fermentation medium were the most important factors affecting the production of anti-Fusarium solonisubstances and their optimum levels were 10, 10.2 g/L and 25.8 g/L, respectively. The anti-Fusarium solonipotency of the fermentation supernatant obtained under these optimum levels was 71.3784 AU/mL, much higher than before optimization (45.9669 AU/mL).

Key words：StreptomycesHD-010；fermentation；response surface optimization

辣椒根腐病是典型土傳病害，一般化學(xué)農(nóng)藥難以控制其危害，并且化學(xué)農(nóng)藥的長期反復(fù)和大量使用，會加重土壤農(nóng)藥的殘留，破壞生態(tài)環(huán)境，使食品的安全性降低，影響人類健康，更不符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求[1-2]。而生物農(nóng)藥具有選擇性高、安全性好、易于降解、不易積累、用量少、污染小等優(yōu)點，因此亟待有新的、有效的微生物農(nóng)藥新品種或新劑型投放市場，以滿足該領(lǐng)域的需求。菌株HD-010為微生物學(xué)黑龍江省高校重點實驗室從黑龍江地區(qū)土壤中自行分離得到的一株對辣椒根腐病菌拮抗性較好的鏈霉菌(Streptomycessp.)，是一株極具開發(fā)潛力的生防菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件對微生物發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量有很大的影響[3-4]。調(diào)整培養(yǎng)基中各物質(zhì)的配比，可以改善菌體的生長條件，提高發(fā)酵液效價。響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法[5-7]，其中的中心復(fù)合設(shè)計應(yīng)用廣泛，可用于確定試驗因素及其交互作用在工藝過程中對目標(biāo)響應(yīng)值的影響，精確地表述因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。通過利用中心組合試驗擬合出一個完整的二次多項式模型，在試驗設(shè)計與結(jié)果表述方面更加準(zhǔn)確。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者采用響應(yīng)面分析的試驗方法優(yōu)化微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件都取得了很好的效果[8-13]。本實驗通過響應(yīng)面優(yōu)化法對鏈霉菌菌株HD-010的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高其代謝活性物質(zhì)的產(chǎn)量，為進(jìn)一步生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

拮抗鏈霉菌H D-010；指示菌：辣椒根腐病菌(Fusarium soloni)以上菌株均由黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

原始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25g、蔗糖20g、黃豆粉50g、NaCl 4g、K2HPO40.2g、CaCO33g、蒸餾水1000mL，pH7.0。

1.3 發(fā)酵液效價的測定[14]

發(fā)酵上清液的制備：將拮抗鏈霉菌HD-010接入高氏Ⅰ號液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5d，將發(fā)酵液在6000r/min，離心10min，取上清液，過細(xì)菌濾器，得到發(fā)酵上清液即待測液。

采用雙層平板法。將10mL瓊脂培養(yǎng)基平鋪于9cm直徑的平皿中，置于水平臺面上使瓊脂層形成均勻厚度，然后取新鮮培養(yǎng)并稀釋到孢子濃度為108個/mL的辣椒根腐病菌菌懸液200μL于溫?zé)岬?mL PDA瓊脂試管中，倒于平皿中，輕輕混勻，置于水平臺面上保持培養(yǎng)基厚度一致。在雙層檢測平板上等距離擺放已滅菌的無菌牛津杯，在牛津杯中加入稀釋2倍的200μL待測液，加于3個間隔放置的牛津杯中，以已知效價值的中心濃度發(fā)酵上清液為對照加入另外3個間隔的牛津杯中，然后置于指示菌生長溫度28℃恒溫培養(yǎng)72h，觀察抑菌圈的出現(xiàn)，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑，讀數(shù)精確到0.01mm，重復(fù)3個平板。將樣品抑菌圈直徑與對照抑菌圈直徑的差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算可得樣品的效價值。

系列稀釋法將發(fā)酵上清液用pH7.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液進(jìn)行二倍稀釋，取樣200μL進(jìn)行抑菌實驗，觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為一個活力單位(AU)，其倒數(shù)即是原液的效價值。

效價值標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：先將經(jīng)稀釋法測量己知效價值的發(fā)酵液等比稀釋成9種濃度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，分別取200μL加于已制備好平板的3個間隔的牛津杯中，同時將200μL中心濃度的發(fā)酵上清液(即稀釋至0.5倍的發(fā)酵上清液)加入另外間隔的3個牛津杯中，每個濃度重復(fù)3個平板，以所得到的對應(yīng)抑菌圈直徑的差值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的效價值的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的效價值計算公式為y＝0.0436x+1.6021。

1.4 試驗設(shè)計

以發(fā)酵液的效價值為響應(yīng)值，采用兩步法進(jìn)行優(yōu)化：首先利用Plackett-Burman設(shè)計篩選出對響應(yīng)值影響較大的因素；然后再利用中心復(fù)合設(shè)計進(jìn)行試驗，通過試驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)試驗條件，并進(jìn)行驗證實驗。

1.4.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，用玉米粉代替黃豆餅粉拮抗菌株發(fā)酵液的抑菌效果較好。利用Plackett-Burman試驗設(shè)計，對葡萄糖(X1)、蔗糖(X2)、玉米粉(X3)、氯化鈉(X4)、碳酸鈣(X5)、磷酸氫二鉀(X6)、裝液量(X7)、接種量(X8)和pH值(X9)9個試驗因素進(jìn)行篩選，從而篩選出顯著因素。每個因素分別取低水平(－1)和高水平(1)，響應(yīng)值為菌株HD-010發(fā)酵液的效價值，其取值見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平取值Table 1 Variables and levels in the Plackett-Burman experimental design

1.4.2 中心組合試驗

篩選出關(guān)鍵因素后，應(yīng)用Design-Expert 7.1.3軟件，采用中心組合試驗設(shè)計，以接近最佳值的顯著因素取值作為試驗中心點進(jìn)行優(yōu)化，選擇N=20的中心組合試驗設(shè)計方案，所得結(jié)果應(yīng)用軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。通過回歸擬合全局范圍內(nèi)顯著因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，可以得到模型中的各個系數(shù)。再對該多元函數(shù)進(jìn)行簡單的性狀分析可得出其極值點以及取得極值的相應(yīng)自變量的取值(表2)。

表2 中心組合試驗設(shè)計因素及水平Table 2 Variables and levels in the central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果與分析

Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果見表3，采用Design-Expert 7.1.3軟件對表3中效價值進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子偏回歸系數(shù)及顯著性(表4)。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experimental design matrix and results

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis for the Plackett-Burman experimental results

由表4可知，方程分析模型的P值為0.0490，表明該模型在被研究的回歸區(qū)域擬合很好；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9889，說明相關(guān)性較好，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9390表明93.90%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋；變異系數(shù)(CV)越低，試驗的可信度和精確度越高，CV值等于7.68%，表示Plackett-Burman試驗的可信度和精確度較好；精密度(adeq precision)是有效信號與噪音的比值，大于4.0視為合理，本試驗精密度達(dá)到了9.539。

從表4可看出，X1、X2、X3、X8這4個因素的P值小于0.05，為顯著影響因素，其中X8為接種量，是正效應(yīng)因素，而X1、X2、X3均為培養(yǎng)基成分，因此選擇X1、X2、X3這3個因素進(jìn)行中心組合設(shè)計，將X8接種量固定為6%。

2.2 中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化結(jié)果與響應(yīng)面分析

表5 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Central composite design matrix and results

表6 中心組合試驗結(jié)果二階方差分析Table 6 Variance analysis for the central composite experimental results

對Plackett-Burman試驗中篩選出的顯著因素進(jìn)行優(yōu)化中心組合試驗設(shè)計，各因素水平取值見表2，表5為中心組合試驗設(shè)計及其結(jié)果。

采用Design-Expert 7.1.3對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合二次模型方差分析見表6。F值為5.21，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.8388，表明83.88%的發(fā)酵液效價的變化可以由此模型解釋，說明模型對實際情況擬合較好；模型的P值為0.0110表明該模型顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測。校正決定系數(shù)R2Adj=0.6777表明67.77%試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋；CV值等于11.64%，表示中心組合試驗的可信度和精確度較好；本試驗精密度達(dá)到了9.975。

通過軟件Design-Expert 7.1.3進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而尋求最優(yōu)相應(yīng)因素水平，回歸方程偏回歸系數(shù)的估計值見表7。對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多項式回歸分析，擬合得回歸二次方程為：

表7 中心組合試驗回歸分析結(jié)果Table 7 Regression analysis for the central composite experimental results

用Design-Expert 7.1.3繪制回歸方程分析圖，考察所擬合曲面的形狀，響應(yīng)曲面如圖1～3。

圖1 葡萄糖和蔗糖質(zhì)量濃度對菌株HD-010發(fā)酵影響曲面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of glucose and sucrose concentrations on the production of anti-Fusarium solonisubstances

圖2 葡萄糖和玉米粉質(zhì)量濃度對菌株HD-010發(fā)酵影響曲面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of glucose and corm meal concentrations on the production of anti-Fusarium solonisubstances

圖3 蔗糖和玉米粉質(zhì)量濃度對菌株HD-010發(fā)酵影響曲面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour pots showing the effects of sucrose and corn meal concentrations on the production of anti-Fusarium solonisubstances

由表7和圖1～3可看出二次模型中回歸系數(shù)的顯著性：因素C對菌株HD-010發(fā)酵液效價的線性效應(yīng)顯著，因素M1和M2不顯著；M1M3和M2M3對菌株HD-010發(fā)酵液效價交互作用影響顯著，而M1M2不顯著；對菌株HD-010發(fā)酵液效價影響顯著，而和M22不顯著。

2.3 驗證實驗

由設(shè)計軟件得到39組優(yōu)化條件，選取3組發(fā)酵條件進(jìn)行驗證實驗，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件為對照，結(jié)果見表8。

表8 驗證實驗結(jié)果Table 8 Results of verification experiments on optimized glucose,sucrose and corn flour concentrations

由表8可知，預(yù)測精度分別達(dá)到了97.72%、95.92%和92.78%，表明實驗值和實際值間有較好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。對照組實際測得效價為45.9669AU/mL。證明了Plackett-Burman篩選和中心組合試驗設(shè)計方法聯(lián)用對于發(fā)酵條件優(yōu)化的可行性和準(zhǔn)確性，因此該方法對于其他發(fā)酵條件優(yōu)化也具有一定的參考價值。

3 結(jié) 論

將Plackett-Burman 篩選和RSM分析相結(jié)合，成功地應(yīng)用于鏈霉菌HD-010菌株發(fā)酵產(chǎn)抗辣椒根腐病菌活性物質(zhì)的條件優(yōu)化，最終確定優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為：葡萄糖10g/L、蔗糖10.2g/L、玉米粉25.8g/L、氯化鈉1g/L、碳酸鈣1g/L、接種量6%、裝液量30mL/250mL三角瓶、pH8.0、發(fā)酵溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速250r/min及發(fā)酵時間5d。采用此優(yōu)化配方得到發(fā)酵液效價最高值為71.3784，而對照組效價值為45.9669，菌株HD-010最終效價比原始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液即對照組提高了55.28%。

[1] 郭彩霞, 袁靈恩, 秦娜. 保護(hù)地辣椒根腐病的發(fā)生及綜合防治[J]. 植物保護(hù), 1999(6):24-25.

[2] 劉麗云. 不同殺菌劑防治辣椒根腐病的效果研究[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(1):5-6.

[3] 任灝翔, 戴玲妹, 劉德華. 使用大米粉液化糖化液發(fā)酵井岡霉素A[J].農(nóng)藥, 2003, 42(15):12-13.

[4] 劉紅宇, 趙儀英. 中生菌素高產(chǎn)菌的選育及發(fā)酵條件的研究[J]. 中國抗生素雜志, 2002, 27(4):246-248.

[5] AMBAT P, AYYANNA C. Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric production from palmyra jaggery using response surface methods[J]. World Journal of Microbiology &Biotechnology, 2001, 17(1):331-335.

[6] 高修功, 王超, 章克昌. 數(shù)學(xué)統(tǒng)計法快速優(yōu)化假單胞菌脂肪酶發(fā)酵條件[J]. 微生物學(xué)通報, 1998, 25(2):94-95.

[7] 褚以文. 微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法及其OPTI優(yōu)化軟件[J]. 國外醫(yī)藥:抗生素分冊, 1999, 20(2):58-60.

[8] 郝學(xué)財, 余曉斌, 劉志鈺, 等. 響應(yīng)面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(1):38-40.

[9] AMBATI P, AYYANNA C. Optimizingmedium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface method[J]. World Journal of Microbiology &Biotechnology, 2001, 17(2):331-335.

[10] LU W K, CHIU T Y, HUNG S H, et al. Use of response surface methodology to optimize culture medium for production of poly-γglutamic acid byBacillus licheniformis[J]. International Journal of Applied Science and Engineering, 2004, 2(1):49-58.

[11] RATNAM B V V, NARASIMHA R A O M, DMODAR R A O M, et al.Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2003, 19(1):523-526.

[12] TRUPKIN S, LEVIN S, FORCHIASSIN F. Optimization of a culture medium for lig-ninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J]. J Ind Microbiol Biotechnol,2003, 30(2):682-690.

[13] MURALIDHAR R V, CHIRUMAMILA R R, MARCHANT R, et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindraceausing two different carbon sources[J]. Biochem Eng,2001, 9(2):17-23.

[14] 呂燕妮. 戊糖乳桿菌31-1菌株產(chǎn)細(xì)菌素研究[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

Response Surface Optimization of Medium Composition and Fermentation Conditions for the Production of Anti-Fusarium soloniSubstances byStreptomycesHD-010

ZHANG Hai-xiu1，DU Chun-mei2,*
(1. College of Sciences, Harbin University, Harbin 150086, China；2. College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Q815

A

1002-6630(2010)17-0340-05

2010-06-29

黑龍江省新世紀(jì)高等教育教學(xué)改革工程項目(5775)

張海秀(1978—)，女，實驗師，碩士，研究方向為應(yīng)用微生物、微生物發(fā)酵技術(shù)。E-mail：zhxdd.123@163.com

*通信作者：杜春梅(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為生物防治。E-mail：80110507@sina.com