5種野生漿果的抗氧化和抗細(xì)胞增殖活性

樊梓鸞，王振宇,2,*，程翠林，趙海田，張 華

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090； 2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

5種野生漿果的抗氧化和抗細(xì)胞增殖活性

樊梓鸞1，王振宇1,2,*，程翠林1，趙海田1，張 華1

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090； 2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

選取東北大興安嶺地區(qū)的特色漿果花楸(Sorbus pohuashanensisH.)、藍(lán)莓(Vaccinium uliginosumL.)、藍(lán)靛果(Lonicera caeruleaL.)、沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)、草莓(Fragaria orientalisLos.)的成熟果實(shí)，采用80%丙酮提取，分別測(cè)定多酚、黃酮、花色苷含量，并研究其抗氧化活性和抗細(xì)胞增殖活性。結(jié)果表明：花楸的多酚和黃酮含量最高；藍(lán)靛果的花色苷含量最高，為(367.5± 8.7)g/100g；5種漿果都具有較好的體外抗氧化活性，花楸顯示了最高的抑制癌細(xì)胞增殖效應(yīng)。

漿果；多酚；抗氧化；抗細(xì)胞增殖

Abstract：Some wild berries have been shown to have the functions of protecting against cardiovascular diseases, diabetes, and cancers due to the existence of phenolics. In the present study, the ripe fruits of five wild berries,Sorbus pohuashanensisH.(rowanberry),Vaccinium uliginosumL. (blue honeysuckle),Lonicera caeruleaL.,Hippophae rhamnoidesL., andFragaria orientalisLos., selected from the Greater Higgnan Mountains area of Northeast China were extracted with 80% acetone and the extracts were measured for their contents of total phenolics, total flavonoids and anthocyanins, ABTS+·, DPPH and total oxyradical scavenging capacities and anti-proliferative activities against HepG2 and HT29 cell (MTS assay). The results showed that rowanberry had the highest contents of total phenolics and total flavonoids among all the five berries, while blue honeysuckle had the highest anthocyanin content (367.5±8.7) g/100 g. All the five berry extracts could exert antioxidant activitiesin vitro, of which rowanberry showed the highest inhibition effects on the proliferation of HepG2 and HT29 cells. As a conclusion,rowanberry has a huge potential for being developed as effective cancer drugs.

Key words：berries；phenolics；antioxidant activity；antiproliferative activity

自由基是人體組織中許多生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物。正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡中，但若是體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或消除過(guò)慢，自由基就會(huì)在分子水平、細(xì)胞水平以及器官水平產(chǎn)生毒害作用，損傷細(xì)胞成分、破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，給機(jī)體造成損傷，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)之為氧化應(yīng)激或氧脅迫(oxidative stress)[1]。飲食多酚類(lèi)化合物可以作為抗氧化劑，啟動(dòng)細(xì)胞的天然防御機(jī)制，預(yù)防由自由基產(chǎn)生的損傷和阻斷癌癥的發(fā)生[2]。

野生漿果中富含植物化學(xué)物，其提取物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以減少脂質(zhì)過(guò)氧化，降低膽固醇[3]以及抑制結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。漿果中天然存在的植物化合物的聯(lián)合作用在抗氧化以及腫瘤預(yù)防方面至關(guān)重要[4]。通過(guò)漿果中多酚、類(lèi)黃酮以及花色苷功能物質(zhì)含量的檢測(cè)以及探討漿果提取物抗氧化和抗腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)于揭示漿果提取物預(yù)防腫瘤的作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)研制新型抗癌藥物具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花楸(Sorbus pohuashanensisH.)、藍(lán)莓(Vaccinium uliginosumL.)、藍(lán)靛果(Lonicera caeruleaL.)、沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)、草莓(Fragaria orientalisLos.)，于成熟季節(jié)采摘于大興安嶺加格達(dá)奇，冷凍保存。

(+)-Catechin、Folin-Ciocalteu(FC) reagent、DPPH、ABTS、4-甲硫基-2-丁酮酸鈉鹽(KMBA)、Trolox Sigma公司；2,2’- 偶氮雙(2-瞇基丙烷)二鹽酸鹽(ABAP)日本W(wǎng)ako Chemical公司；硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、鹽酸、胎牛血清、氯化鋁、亞硝酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀、10mL硬質(zhì)頂空瓶 美國(guó)Agilent 公司；恒溫振蕩水浴箱 上?？破鞴荆籎J-2型組織粉碎機(jī) 常州國(guó)華公司；FA25型高速均質(zhì)機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；550 iMark酶標(biāo)儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 活性成分的提取

用電子天平精確稱(chēng)取凍存漿果100g，加入200mL 冷凍的80%丙酮在組織搗碎機(jī)中勻漿5min，從搗碎機(jī)中取出勻漿，在高速均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)3min，真空抽濾。收集濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約10%的提取液，將其轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容分裝，于－80℃儲(chǔ)存[5]，用于后續(xù)抗氧化和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 抗氧化物質(zhì)的測(cè)定

1.3.2.1 總酚的測(cè)定

采用菲林酚比色法檢測(cè)多酚含量[6]。精密吸取125μL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或漿果提取物，分別置于l0mL試管中，加入0.5mL的蒸餾水，再加入125μL的菲林酚試劑(FCR)，樣品混合充分，靜置6min，加入1.25mL 7g/100mL Na2CO3水溶液。用水補(bǔ)足終體積到3mL。90min后在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定藍(lán)色溶液的吸光度。沒(méi)食子酸作標(biāo)品，結(jié)果以沒(méi)食子酸等同量(mg)/l00g鮮質(zhì)量表示。

1.3.2.2 黃酮的測(cè)定

采用AlCl3比色法檢測(cè)總黃酮含量[7]。兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以mg/l00g鮮質(zhì)量表示。精密吸取0.25mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液或漿果提取物，分別置于l0mL試管中，加入0.5mL的蒸餾水，再加入75μL 5g/100mL NaNO3溶液，混合均勻，6min后加入150μL 10g/100mL AlCl3·6H2O，搖勻放置5min；然后加入0.5mL lmol/L的NaOH溶液，用水補(bǔ)足終體積到2.5mL，混勻，于波長(zhǎng)510nm條件下，利用分光光度計(jì)比色，以試劑為空白參比，測(cè)定不同溶液的吸光度。

1.3.2.3 花色苷的測(cè)定

單節(jié)花青素含量用pH示差分光光度法[8]。提取物用0.025mol/L pH 1的氯化鉀緩沖液及pH 4.5乙酸鈉緩沖液按比例混合，分別在515nm和700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為空白比色?；ㄇ嗨氐暮坑檬?1)計(jì)算?？倖位ㄇ嗨?(mg/100g鮮果)＝A×MW×1000×E×c(1)

式中：A為吸光率(A515nm－A700nm)pH1.0－(A515nm－A700nm)pH4.5；MW為花色苷3-糖配基的相對(duì)分子質(zhì)量449.2；E為花色苷3-糖配基的摩爾吸光率26900；c為緩沖溶液的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；每100g鮮果皮中花色苷的含量用花色苷3-糖配基的毫克數(shù)表示。

1.3.3 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH法測(cè)定抗氧化能力

參照文獻(xiàn)[9]，將樣品稀釋配制成一系列濃度，取0.1mL樣品加入1.5mL DPPH甲醇溶液，混合30min后測(cè)定515nm波長(zhǎng)處吸光度。每份樣品平行操作3次，按照公式(2)計(jì)算清除率。

式中：AContral為1.5mL DPPH溶液與0.1mL甲醇混合后的吸光度；ASample為1.5mL DPPH溶液與0.1mL樣品混合后的吸光度。

1.3.3.2 ABTS法測(cè)定抗氧化能力

按照文獻(xiàn)[8]。配制ABTS自由基工作液。將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL樣品加入1.5mL ABTS自由基工作液，混合，放置6min后，在734nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次，按照公式(3)計(jì)算清除率。

式中：AContral為1.5mL ABTS溶液與0.1mL甲醇混合后的吸光度；ASample為1.5mL ABTS溶液與0.1mL樣品混合后的吸光度。

1.3.3.3 TOSC法測(cè)定總氧自由基清除能力

以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配制0.2mol/L ABAP、0.25mmol/L KMBA(均為臨用時(shí)現(xiàn)配，4℃避光貯存)，在頂空瓶中加入KMBA 0.8mL和PBS 0.1mL作為控制管，加人KMBA 0.8mL和樣液0.1mL (0.4～40 mg/mL)作為樣品管，分別加蓋密封后用注射器注入0.1mL ABAP，使溶液終體積為1mL。將頂空瓶放入35℃水浴振蕩反應(yīng)60min，立即抽取頂空氣體0.6mL按1.3.4節(jié)條件進(jìn)樣[10]。按照公式(4)計(jì)算總氧自由基清除能力。

式中：AS和AC分別為樣品管和控制管的乙烯峰面積。

1.3.4 氣相色譜測(cè)試條件

測(cè)試條件：安捷倫HP-PLOT Q毛細(xì)管柱 (15m×0.530mm，40μm)；進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器溫度分別為100、40、300℃；載氣(N2)：氫氣、空氣流速分別為40、50、500mL/min；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器(FID)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

用Sigmaplot 10.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值計(jì)算采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化物質(zhì)含量的比較

5種漿果提取物的多酚、黃酮、花色苷含量如圖1所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知，不同漿果中多酚、黃酮、花色苷含量差異性顯著(P＜0.001)。多酚和黃酮在花楸漿果中含量最高，分別達(dá)到(625.3±6.9)mg/100g和(556.4±15.7)mg/100g；在草莓漿果中含量只有(127±31.6)mg/100g和(94.2±11.7)mg/100g；而花色苷在藍(lán)靛果中含量最高，為(358.8±16.4)mg/100g 鮮果，其次為藍(lán)莓、草莓、花楸和沙棘。此結(jié)果與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的漿果提取物相比，花楸的多酚和黃酮含量顯著高于其他漿果，草莓含量相比低于文獻(xiàn)報(bào)道，可能由于植物生長(zhǎng)環(huán)境和種屬基因型對(duì)酚類(lèi)化合物的積累起主要因素。

圖1 5種漿果樣品總酚含量Fig.1 Contents of total phenolics of five wild berries (mg/100 g)

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 ABTS+·和 DPPH自由基法測(cè)定提取物的抗氧化活性

一般來(lái)講，自由基化學(xué)性質(zhì)活潑，壽命極短，但也有例外，ABTS+·和 DPPH自由基是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的性質(zhì)穩(wěn)定的自由基，常用于抗氧化活性的篩選[12-13]。5種漿果對(duì)ABTS+·和 DPPH自由基的清除能力見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著加入質(zhì)量濃度的增大，各種漿果清除ABTS+·和 DPPH自由基的能力也依次增強(qiáng)，呈良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。但5種漿果的清除活性存在一定差異。多酚含量高的花楸和藍(lán)靛果對(duì)ABTS+·和 DPPH自由基的清除活性也相對(duì)較強(qiáng)。當(dāng)加入質(zhì)量濃度為40mg/mL時(shí)，花楸和藍(lán)靛果提取物對(duì)ABTS+·的清除率分別達(dá)到96.12%和95.03%；當(dāng)加入質(zhì)量濃度為150mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率分別達(dá)到80.05%和80.23%，而多酚含量最低的草莓在以上兩種質(zhì)量濃度下，對(duì)A B T S+·和DPPH自由基的清除率僅為46.66%和25.82%。5種漿果自由基清除活性的EC50值顯示其清除活性的大小順序依次為花楸＞藍(lán)靛果＞藍(lán)莓＞沙棘＞草莓。明顯可以看出，DPPH法評(píng)價(jià)出的抗氧化能力比ABTS法要低?？赡苁怯捎贒PPH對(duì)親水性的抗氧化物質(zhì)不太敏感[14]。所以在評(píng)價(jià)抗氧化能力時(shí)，應(yīng)采用多種方法來(lái)綜合評(píng)價(jià)。

圖2 5種漿果提取物清除ABTS+·和DPPH自由基的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig.2 Dose-response curves of ABTS+· and DPPH radical scavenging activity of five berry extracts

2.2.2 TOSC法測(cè)定總氧自由基清除能力

Winston等[10]建立了一種以氣相色譜為檢測(cè)手段測(cè)定機(jī)體的總氧自由基清除能力(total oxyradical scavenging capacity，TOSC)的方法，該方法和其他同類(lèi)測(cè)定抗氧化能力的方法相比，除了具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速、對(duì)儀器設(shè)備無(wú)特殊要求等優(yōu)點(diǎn)外，它最大的優(yōu)越性是任何可與氧自由基結(jié)合的物質(zhì)所發(fā)揮的作用都被考慮，因而反映的是機(jī)體所具有的總抗氧化能力，這在評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)生物是否造成氧化損傷時(shí)有特別重要的意義，這是單項(xiàng)抗氧化劑指標(biāo)所無(wú)法比擬的。此外，由于TOSC的計(jì)算是將加入樣品所得乙烯的峰面積與對(duì)照相比，因而所得的TOSC受儀器靈敏度的變化及其他分析狀態(tài)的影響較小，因此，其可行性和重現(xiàn)性也較好。

5種漿果均有較強(qiáng)的總氧自由基清除能力，隨著漿果提取液加入濃度的增大，乙烯峰面積也隨之減小，并呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。根據(jù)樣品不同濃度的TOSC值擬合方程可求出抑制乙烯生成50%時(shí)各種樣品的濃度(EC50)。以VC為對(duì)照，結(jié)果表示為每g樣品相當(dāng)于多少 VC的量(μmol)。其值越高說(shuō)明抗氧化能力越強(qiáng)。由圖3可知，5種漿果總抗氧化活性有所不同，其總抗氧化活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋夯ㄩ保舅{(lán)靛果＞藍(lán)莓＞沙棘＞草莓。此結(jié)果與多酚含量及對(duì)ABTS+·和DPPH自由基的清除活性顯著相關(guān)。結(jié)果指出，樣品的植物化學(xué)提取物發(fā)揮了潛在的抗氧化活性。不同的漿果，處理方法不同，栽培條件或是儲(chǔ)存條件都會(huì)顯著影響總抗氧化物含量[15]。

圖3 5種漿果提取物的總抗氧化活性Fig.3 Total oxyradical scavenging capacities of 5 berry extracts

2.3 抗細(xì)胞增殖活性分析

圖4 5種漿果提取物抗細(xì)胞增殖活性的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig.4 Dose-response curves of antiproliferative activity of 5 berry extracts

癌癥是人體細(xì)胞失去正常調(diào)控機(jī)制而失控性生長(zhǎng)的一種疾病。癌癥可發(fā)生于任何器官中的任何組織。從基因的角度來(lái)講，就是各種原因?qū)е掳┗虻募せ詈?或抑癌基因的失活，使基因突變的細(xì)胞失去調(diào)控而不斷復(fù)制，由此對(duì)人體組織器官產(chǎn)生損害。

當(dāng)前，抗癌主要研究方向是抑制腫瘤發(fā)生、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化或凋亡。凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式，以保證機(jī)體的正常功能。氧化應(yīng)激(oxidative stress)是導(dǎo)致化學(xué)的或代謝來(lái)源的ROS產(chǎn)生的一種細(xì)胞內(nèi)或外的狀態(tài)。現(xiàn)已探明腫瘤細(xì)胞中氧自由基及其代謝產(chǎn)物明顯高于正常組織，這些自由基是癌細(xì)胞內(nèi)某些基因(如Ras等)生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要環(huán)節(jié)，可刺激腫瘤細(xì)胞分裂、增殖，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡等代謝活動(dòng)[16]。因此，開(kāi)發(fā)天然來(lái)源的新抗腫瘤藥物，可有效的清除腫瘤細(xì)胞中氧自由基，抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，對(duì)癌癥的預(yù)防和控制起到了舉足輕重的作用。

從圖4可以看出，5種漿果提取物對(duì)結(jié)腸癌HT29和肝癌HepG2細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，其抑制作用成質(zhì)量濃度依賴(lài)性，抑制率隨提取物質(zhì)量濃度的升高而增加?；ㄩ碧崛∥飳?duì)兩種細(xì)胞的抑制作用隨質(zhì)量濃度的變化較其他4種顯著。經(jīng)計(jì)算得出，花楸提取物與HT29和HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)48h后測(cè)得EC50分別為38.01mg/mL和25.65mg/mL。

由圖5可知，對(duì)于結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖活性依次為花楸＞藍(lán)莓＞沙棘＞草莓＞藍(lán)靛果；而對(duì)于人肝癌HepG2細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖活性依次為花楸＞沙棘＞藍(lán)莓＞草莓＞藍(lán)靛果。

3 討 論

隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的逐步發(fā)展，活性氧和自由基研究已成為近20年來(lái)該領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)。1956年，英國(guó)科學(xué)家首先提出了自由基學(xué)說(shuō)，認(rèn)為自由基攻擊生命大分子造成組織細(xì)胞損壞，是引起機(jī)體病變的重要原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。

近年來(lái)，關(guān)于天然產(chǎn)物抗氧化活性的研究十分引人注目，從天然材料提取、精制而得到的產(chǎn)品——天然產(chǎn)物對(duì)人體的多種疾病往往具有很好的治療、預(yù)防等藥理作用和保健功能[17]。據(jù)報(bào)道，自然界中的蔬菜、水果、花和谷物中存在具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，其中一些天然產(chǎn)物在抗氧化性、清除自由基作用方面有突出的表現(xiàn)，這對(duì)于抗癌、防癌、抗衰老、預(yù)防心血管疾病，提高人民身體健康會(huì)產(chǎn)生積極的作用。

本實(shí)驗(yàn)較為系統(tǒng)地研究了我國(guó)北方特產(chǎn)的5種野生漿果的酚類(lèi)化合物組成、抗氧化活性和抗細(xì)胞增殖活性。在3種抗氧化體系中，花楸、藍(lán)靛果和藍(lán)莓表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，沙棘和草莓次之，其抗氧化活性與提取物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。花楸對(duì)兩種癌細(xì)胞的抑制活性最強(qiáng)，藍(lán)靛果對(duì)癌細(xì)胞的抑制活性較弱，與其多酚含量沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

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Antioxidant and Antiproliferative Activities of Five Wild Berries

FAN Zi-luan1，WANG Zhen-yu1,2,*，CHENG Cui-lin1，ZHAO Hai-tian1，ZHANG Hua1
(1. College of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China；2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

TS201.4；R151.3

A

1002-6630(2010)17-0148-05

2010-06-29

樊梓鸞(1981—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化及功能性。E-mail：fzl_1122@163.com

*通信作者：王振宇(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榛钚猿煞址蛛x合成與調(diào)控、新資源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：wzy219001@yahoo.com.cn