真姬菇液體菌種培養(yǎng)基篩選和搖瓶發(fā)酵條件的研究

王麗娟，劉林德，卜慶梅，王愛云，王淑芳

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

真姬菇液體菌種培養(yǎng)基篩選和搖瓶發(fā)酵條件的研究

王麗娟，劉林德，卜慶梅，王愛云，王淑芳

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

采用搖瓶培養(yǎng)法對(duì)真姬菇液體菌種培養(yǎng)基篩選和發(fā)酵條件進(jìn)行研究。研究表明，真姬菇液體菌種最佳組合培養(yǎng)基為：葡萄糖3g/100mL、玉米淀粉1g/100mL、黃豆粉1.5g/100mL、(NH4)2SO40.3g/100mL、KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL和VB110mg/L。真姬菇搖瓶發(fā)酵最佳條件為：起始pH值為6.0，500mL錐形瓶裝液量140～150mL，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，溫度26℃，二級(jí)搖瓶發(fā)酵時(shí)間72h，接種量10%～12%。

真姬菇；培養(yǎng)基篩選；發(fā)酵條件

Abstract：In this study, medium composition and process conditions for the liquid-state incubation ofHypsizigus marmoreusin a shake flask were explored. The optimal medium composition was found to consist of 3 g/100 mL glucose, 1 g/100 mL corn starch, 1.5 g/100 mL soybean cake, 0.3 g/100 mL (NH4)2SO4, 0.2 g/100 mL KH2PO4, 0.1 g/100 mL MgSO4·7H2O and 10 mg/L Vitamin B1. Initial pH of 6.0, medium volume contained in a 500 mL flask of 140－150 mL, shaking speed of 180 r/min, incubation temperature of 26 ℃, incubation time of 72 h and inoculum size of 10%－12% were found optimal.

Key words：Hypsizigus marmoreus；medium selection；incubation conditions

真姬菇(Hypsizigus marmoreus)又名玉蕈、蟹味菇，隸屬擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目白蘑科玉蕈屬[1]。真姬菇是一種珍稀名貴食用菌，它含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素，具有高蛋白、低脂肪、低熱量的特點(diǎn)。真姬菇子實(shí)體蛋白質(zhì)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，氨基酸評(píng)分(AAS)、化學(xué)評(píng)分(CS)、營(yíng)養(yǎng)指數(shù)(NI)和氨基酸比值系數(shù)分(SRCAA)4項(xiàng)指標(biāo)均比參比食用菌高[2]。同時(shí)，真姬菇是一種深受消費(fèi)者青睞的保健食品。真姬菇多糖等提取物具有較好的清除超氧自由基和羥自由基活性，經(jīng)常食用具有提高人體免疫力、預(yù)防衰老、延長(zhǎng)壽命的功效[3-6]。

中國(guó)從20世紀(jì)80年代起對(duì)真姬菇開展生物學(xué)特性和栽培條件研究[7-10]。但目前的栽培大多沿用傳統(tǒng)的固體菌種接種方法，萌發(fā)速度慢，易污染，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)效益低。用液體菌種接種，菌絲球數(shù)量多，萌發(fā)點(diǎn)多，生長(zhǎng)速度快，不宜污染，周期短，成本低，適宜工廠化栽培，有著廣闊的前景。近年來有關(guān)真姬菇等液體培養(yǎng)基的篩選已有研究[11-15]，但以發(fā)酵菌絲為目的用于真姬菇液體菌種生產(chǎn)的有關(guān)研究只見少量報(bào)道[16]。本實(shí)驗(yàn)以菌絲體干質(zhì)量濃度為指標(biāo)，篩選適宜真姬菇液體菌種生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，旨在為大規(guī)模栽培真姬菇提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

真姬菇(Hypsizigus marmoreus)由山東省食用菌工作站提供。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖3g/100mL、蛋白胨1g/100mL、KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL、VB110mg/L。

1.3 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基

葡萄糖3g/100mL、麩皮4g/100mL、土豆20g/100mL、KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL、VB110mg/L。

1.4 測(cè)定方法

菌絲體干質(zhì)量的測(cè)定：發(fā)酵液經(jīng)雙層紗布過濾后，菌絲體用水沖洗干凈，60℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，稱其質(zhì)量，重復(fù)3次。菌球密度的測(cè)定：取1mL培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿下面放一張黑白相間的格子紙，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。菌球直徑的測(cè)定：隨機(jī)取15個(gè)菌球，在培養(yǎng)皿中排成一列，測(cè)其總長(zhǎng)度，求平均值。

1.5 搖瓶發(fā)酵條件的設(shè)定

設(shè)定不同的裝液量、起始pH值和接種量。裝液量選用500mL三角瓶，裝液量分別為100、120、140、160、180、200mL；起始pH值分別為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5；接種量(V/V)分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%。

設(shè)定不同的培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間。培養(yǎng)溫度分別為15、18、21、24、27、30℃；搖床轉(zhuǎn)速分別為100、120、140、160、180、200r/min；培養(yǎng)時(shí)間分別為48、72、96、120、144、168h。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響

2.1.1 碳源篩選試驗(yàn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源分別是3g/100mL的葡萄糖、蔗糖、紅糖、白糖、玉米淀粉、小麥粉、玉米粉，以及20g/100mL的土豆、麩皮。以無碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，結(jié)果見表1[17-18]。

表1 不同碳源對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Table 1 Effect of carbon source type onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

從表1可以看出，在供試的10種培養(yǎng)基中，真姬菇以葡萄糖為碳源時(shí)，菌絲體干質(zhì)量最大；在含淀粉較多的碳源培養(yǎng)基中，以玉米淀粉為碳源時(shí)，菌絲體干質(zhì)量最大。因此，選用葡萄糖和玉米淀粉作為碳源比較適宜。

2.1.2 氮源篩選試驗(yàn)

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源分別換成2g/100mL的蛋白胨、麩皮、黃豆粉、花生餅、干酪素、玉米糠及0.2g/100mL的尿素、硫酸銨、硝酸鐵。以無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量。結(jié)果見表2。

表2 不同氮源對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Table 2 Effect of nitrogen source type onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

從表2可以看出，有機(jī)氮中真姬菇以黃豆粉為氮源時(shí)，菌絲體干質(zhì)量最大；在無機(jī)氮中以硫酸銨為氮源時(shí)菌絲體干質(zhì)量最大。因此，選擇黃豆粉和硫酸銨為氮源較適宜。

2.1.3 培養(yǎng)基成分綜合試驗(yàn)

根據(jù)菌絲生長(zhǎng)對(duì)碳氮利用的特點(diǎn)，將有機(jī)氮源、無機(jī)氮源、易利用碳源和相對(duì)較難利用碳源相互組合，選用黃豆粉、硫酸銨、葡萄糖和玉米淀粉，在去碳源和氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入碳源和氮源，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，其結(jié)果見表3、4。

表3 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 3 Factors and levels in the orthogonal array design

從表4可以看出，以菌絲體干質(zhì)量濃度為指標(biāo)，4個(gè)因素對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響主次順序?yàn)锳＞C＞B＞D。葡萄糖質(zhì)量濃度越大，菌絲體干質(zhì)量濃度越高，以葡萄糖3g/100mL的菌絲體干質(zhì)量濃度為最高；玉米淀粉1g/100mL時(shí)菌絲體干質(zhì)量濃度最高；黃豆粉1.5g/100mL時(shí)菌絲體干質(zhì)量濃度最高，硫酸銨0.3g/100mL時(shí)菌絲體干質(zhì)量濃度最高。所以最佳組合為A3B1C3D3，即葡萄糖3g/100mL、玉米淀粉1g/100mL、黃豆粉1.5g/100mL和(NH4)2SO40.3g/100mL。但此正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中未出現(xiàn)此最佳組合，因此進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在此組合條件下，菌絲體干質(zhì)量為1.950g/100mL，在正交試驗(yàn)其他組合的結(jié)果中為最高，因此最佳組合為A3B1C3D3。用最佳組合及微量成分KH2PO40.2g/100mL、MgSO4·7H2O 0.1g/100mL和10mg/L VB1配合即為真姬菇最佳液體培養(yǎng)基。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array layout and experimental results

2.2 不同發(fā)酵條件對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響

2.2.1 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響

絕大多數(shù)食用菌適宜在微酸性環(huán)境中生長(zhǎng)。本研究在確定培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上，在裝液量150mL、接種量12%、溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下培養(yǎng)4d，設(shè)定6個(gè)不同的pH值。結(jié)果表明：菌絲在pH3.0～8.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)；當(dāng)pH4.0～6.0時(shí)，菌絲體干質(zhì)量一直呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值為5.5時(shí)，菌絲體干質(zhì)量最大；繼續(xù)提高pH值，菌絲體干質(zhì)量逐漸減少(圖1)。因此確定真姬菇的最適起始pH值在6.0左右。

圖1 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of medium initial pH onHypsizigusmarmoreusmycelial biomass

2.2.2 裝液量對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響

在pH6.0、接種量12%、溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下培養(yǎng)4d，選擇500mL三角瓶，裝液量分別為100、120、140、160、180、200mL。圖2顯示160mL裝液量菌絲體干質(zhì)量最高，因此選擇150mL進(jìn)行發(fā)酵較適宜。

圖2 裝液量對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of medium volume contained in a 500 mL flask onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

2.2.3 接種量對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響

在pH6.0、裝液量150mL、溫度24℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下，選擇接種量分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%。發(fā)酵4d后，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量。由圖3可知，接種量以9%～12%為宜，因此最佳接種量選擇10%為宜。

圖3 接種量對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of inoculum size onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

2.2.4 溫度對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響

圖4 溫度對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of incubation temperature onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

在pH6.0、裝液量150mL、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的反應(yīng)條件下發(fā)酵4d，設(shè)定6個(gè)不同的溫度進(jìn)行篩選試驗(yàn)。溫度分別設(shè)定15、18、21、24、27、30℃。圖4顯示，隨溫度的升高菌絲量不斷增加，24℃時(shí)菌絲量最高，24～27℃菌絲量差異不明顯，27℃時(shí)菌絲體干質(zhì)量逐漸下降，因而確定24～26℃為最適溫度。

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體干質(zhì)量和菌球直徑的影響

在pH6.0、裝液量150mL、接種量10%、溫度26℃的條件下，設(shè)定轉(zhuǎn)速分別為100、120、140、160、180、200r/min發(fā)酵4d，其結(jié)果見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Fig.5 Effect of shaking speed onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

如圖5所示，轉(zhuǎn)速加快，通氣量增大，菌絲體干質(zhì)量增加；轉(zhuǎn)速達(dá)180r/min時(shí)，菌絲球直徑變小，均勻一致，菌絲體干質(zhì)量最大；當(dāng)轉(zhuǎn)速超過180r/min，片狀增多，大小不一，菌絲體干質(zhì)量下降。因此在搖床轉(zhuǎn)速180r/min下培養(yǎng)較合適。

2.2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響

在pH6.0、裝液量150mL、接種量10%、溫度26℃、轉(zhuǎn)速180r/min的條件下，分別培養(yǎng)48、72、96、120、144、168h。從圖6可以看出，培養(yǎng)至96h時(shí)菌絲體干質(zhì)量最高。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of incubation time onHypsizigus marmoreusmycelial biomass

3 結(jié) 論

3.1 真姬菇對(duì)碳源的利用較為廣泛，對(duì)單糖、寡聚糖、多糖都能利用；但對(duì)單糖的利用最好。有機(jī)氮比無機(jī)氮更利于菌絲生長(zhǎng)。本研究篩選的最佳配方可使菌絲體干質(zhì)量達(dá)1.950g/100mL，高于有關(guān)資料的報(bào)道，并且菌球數(shù)量多，體積小，比較適合用作菌種。

3.2 適宜真姬菇液體培養(yǎng)的條件是：起始pH值為6.0，500mL錐形瓶裝液量為140～150mL，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為26℃，二級(jí)搖瓶發(fā)酵時(shí)間為96h。但二級(jí)搖瓶選擇發(fā)酵時(shí)間選擇為72h的菌齡。雖然72h菌齡的菌絲體干質(zhì)量比96h菌齡的低，但菌絲正處于生命力極為旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種后，有利于菌絲生長(zhǎng)。

3.3 接種量對(duì)菌絲生長(zhǎng)有重要影響，接種量大可縮短發(fā)酵延遲期。但接種量過大，往往使菌絲生長(zhǎng)過快，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶氧不足而影響菌絲生長(zhǎng)。因此真姬菇液體發(fā)酵一般以10%～12%的接種量為宜。

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Screening of Optimal Liquid Medium forHypsizigus marmoreusand Optimization of Its Shake Flask Incubation Conditions

WANG Li-juan，LIU Lin-de，BU Qing-mei，WANG Ai-yun，WANG Shu-fang
(School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China)

Q93.335；S646

A

1002-6630(2010)17-0323-04

2010-06-27

王麗娟(1972—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)樯锝逃龑W(xué)、微生物學(xué)。E-mail：wanglijuan53@126.com