螺旋藻多糖通過腹腔黏膜對小鼠產生的免疫調節(jié)作用

常靜瑤，龐廣昌*，李 楊

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

螺旋藻多糖通過腹腔黏膜對小鼠產生的免疫調節(jié)作用

常靜瑤，龐廣昌*，李 楊

(天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

目的：分析螺旋藻多糖3種不同給藥途徑對小鼠血清中24種細胞因子的影響，進而研究螺旋藻多糖對小鼠的免疫調節(jié)作用。方法：通過灌胃、腹腔注射、尾靜脈注射3種途徑分別給小鼠不同劑量的螺旋藻多糖，對照組給與實驗組同等體積的生理鹽水。灌胃組在3h后眼球取血，腹腔注射和尾靜脈注射組在2h后眼球取血，分離血清，采用Millipore小鼠細胞因子試劑盒和液體芯片掃描儀檢測血清中24種細胞因子的濃度。結果：3種給藥方式小鼠的IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥細胞因子都有不同程度的顯著性升高，說明螺旋藻多糖對炎癥細胞因子的分泌和先天免疫有促進作用。其中，腹腔注射螺旋藻多糖對細胞因子的影響最為顯著，這種方式的信號傳導途徑主要包括NF-κB、MAPK、JAK/STAT等。結論：從螺旋藻多糖對小鼠細胞因子的影響來看，總體上表現(xiàn)出促進免疫的作用，推測螺旋藻多糖主要是通過對腸黏膜系統(tǒng)的受體相互作用，刺激相應細胞產生細胞因子來發(fā)揮其免疫調節(jié)作用和多種生理功能的。

螺旋藻多糖；細胞因子；免疫調節(jié)作用

Abstract：Objective:To analyze the effects of three different administration routes ofSpirulina platensispolysaccharides on 24 cytokines in mouse serum, followed by understanding of the immunoregulatory effect ofSpirulina platensispolysaccharides.Methods:Three administration routes used were oral administration, intraperitoneal injection and intravenous injection at different doses each. Mice orally administered the same volume of normal saline were served as a control group. Serum was separated from eye ball at 3 h after administration for oral administration and at 2 h after administration for intraperitoneal injection and intravenous injection. The contents of 24 cytokines in mouse serum were examined using Milliplex map kit or luminex xMAP technology. Results:Compared with the control group, each treatment group showed significantly higher serum IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α and IFN-γ contents, indicating thatSpirulina platensispolysaccharides have an anxo-action on inflammation cytokines. Among the three administration routes, the effect of intraperitoneal injection on cytokines was the most obvious, and the cell signaling mode of this route mainly consisted of NF-κB，MAPK and JAK/STAT. Conclusion:In general,Spirulina platensispolysaccharides have immunopromoting effect on cytokines, and their immunoregulatory and multiple physiological functions may be exerted through interactions among intestinal mucous membrane receptors and exciting the secretion of cytokines by homologous cells.

Key words：Spirulina platensispolysaccharides；cytokine；immunoregulatory effect

螺旋藻多糖(polysaceharide fromSpirulina platensis，PSP)是從螺旋藻中提取的一種酸性、水溶性的雜多糖，除了具有豐富的營養(yǎng)價值外，還具有多種生物活性和免疫調節(jié)功能，如抗輻射、抑制腫瘤、抗凝血、抗病毒感染以及降低血糖等，已經成為國內外藥物研究開發(fā)的熱點之一[1-3]。

早在1988年中國科學院海洋研究所就發(fā)現(xiàn)螺旋藻多糖可以提高核酸內切酶活性、促進DNA的修復合成，并對體內移植性癌細胞的增殖有明顯抑制作用[4]，這一發(fā)現(xiàn)引起國內生物醫(yī)學界對螺旋藻多糖應用于防輻射和抗癌功能的普遍關注和廣泛研究。為探明其機理，他們通過免疫功能的實驗證明螺旋藻多糖可以提高巨噬細胞的吞噬活性，提高小鼠外周血中T淋巴細胞和血清溶血素的含量，因此螺旋藻多糖不但能提高機體非特異性的細胞免疫，而且能促進機體特異性的體液免疫。而這一系列免疫功能的提高，又與螺旋藻多糖有增強骨髓細胞增殖活力，促進胸腺、脾臟等免疫器官生長和促進血清蛋白生物合成的功能有關[5]。螺旋藻多糖作為一種免疫增強劑，一方面能增強骨髓細胞的增殖活力，有利于巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等免疫細胞的形成和活性的激活；另一方面還能促進IL-2的分泌，通過促進血清蛋白的生物合成調節(jié)機體抗體的形成。有實驗表明，用螺旋藻多糖灌胃或腹腔注射，可以提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，提高外周血中T淋巴細胞和血清溶血素的含量，并且提高小鼠自然殺傷細胞的活力，促進白細胞介素的產生，增強小鼠的免疫機能[6]。螺旋藻多糖還能促進脾、胸腺等免疫器官的生長，減輕或消除免疫抑制劑對機體免疫系統(tǒng)的抑制作用。

本實驗從螺旋藻粉中提取出螺旋藻多糖，以小鼠為研究對象，通過3種不同給藥途徑測定小鼠血清中24種細胞因子濃度的變化，并使用統(tǒng)計軟件對細胞因子的變化情況進行分析，進而研究螺旋藻多糖對免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻粉 內蒙古鄂托克旗烏蘭鎮(zhèn)；小鼠細胞因子試劑盒 Millipore公司。

1.2 實驗動物

Balb/c小鼠，雄性，清潔級，8～9周齡，20～25g/只，購自天津市利居生物用品供應中心。

1.3 儀器與設備

RE-52A旋轉薄膜蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；722型紫外-可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；液體芯片掃描儀 Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 螺旋藻多糖的提取

稱取100g螺旋藻干粉，按固液比1:10(m/V)加入質量分數(shù)0.1%的焦磷酸鈉破壁，按固液比1:9，80℃抽提6h，經4000r/min離心取上清，留上清液，將殘渣進行第二次抽提，將兩次離心所得上清液合并，放入冰箱備用。取上清液，減壓濃縮至原體積的1/5，加入3～5倍體積的95%乙醇沉淀，4℃冰箱中放置12h取出，于4000r/min離心20min，收集沉淀，用蒸餾水將沉淀充分溶解，按固液比1:8制成溶液，調pH值為7.0，加入中性蛋白酶，在50℃保溫2.5h，待完全酶解后，采用Sevag法(Sevag法脫蛋白：將沉淀溶于一定量的水中，加一定量的體積比為3:1的氯仿異戊醇的混合液，振蕩一段時間，4000r/min離心除去沉淀，重復此過程，直至無絮凝物出現(xiàn))進行除蛋白處理7次，去除氯仿層，得水相層。除蛋白后的粗多糖液中加入4倍體積的95%乙醇，使螺旋藻多糖呈絮狀沉淀析出，靜置過夜，取出于4000r/min離心20min，收集沉淀，再用乙醇、丙酮、乙醚抽洗多次，最后冷凍干燥成干粉，即螺旋藻粗多糖，可以長時間保存?zhèn)溆肹7]。

1.4.2 標準曲線的繪制

配制0.5mg/mL的葡萄糖標準溶液和2mg/mL的硫酸-蒽酮溶液，并精密吸取溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于50mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。吸取上述各溶液2mL，另取蒸餾水2mL作為空白對照，置有塞的試管中，加硫酸-蒽酮溶液5mL搖勻，于沸水浴中加熱15min，冷卻，于620nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線并得出方程。

1.4.3 螺旋藻多糖的提取率和純度的測定

準確稱取105℃干燥至質量恒定的螺旋藻多糖50mg，在燒杯中溶解，轉入100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。吸取該溶液2mL，置有塞的試管中，按標準曲線步驟操作，以蒸餾水為空白對照，測定吸光度(A)，由回歸直線方程及其相關系數(shù)求得質量濃度(C)，按式(1)、(2)求多糖純度、多糖提取率。

式中：C為稀釋后硫酸蒽酮法所測吸光度經由回歸直線方程求得的多糖質量濃度/(μg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；m為藻粉質量/g；m1為粗多糖取樣質量/g；m2為藻粉提取所得多糖質量/g；V為樣品溶液總體積/mL。

1.5 動物分組及給藥方法

Balb/c小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分成4組，每組3只：空白對照組、口服灌胃組、腹腔注射組、靜脈注射組?？诜辔附M螺旋藻多糖的給藥劑量為1000mg/kg，腹腔注射組給藥劑量為400mg/kg，靜脈注射組給藥劑量為200mg/kg，對照組給與實驗組同等劑量的生理鹽水。在實驗前一天晚上禁食，口服灌胃組在給藥后3h摘除眼球取血，注射組在給藥后2h摘除眼球取血，4℃離心分離血清(3500r/min，離心15min)，分裝，－20℃保存待測。

1.6 細胞因子的檢測方法

選用Millipore小鼠細胞因子試劑盒，利用最新開發(fā)的Liquichip workstation液相蛋白芯片系統(tǒng)，采用xMAP技術(flexible muti-analyte profiling)，來檢測各種細胞因子的濃度，具體步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.7 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，采用配對t檢驗進行差異顯著性檢驗，所有表格應用Excel軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻多糖提取率和純度的測定

以葡萄糖溶液為標準繪制標準曲線，得到標準曲線方程A=0.0114C+0.001，最佳測量質量濃度為：10～60μg/mL。采用硫酸蒽酮法測定螺旋藻中多糖的提取率和純度，計算出實驗結果：100g螺旋藻中提取的多糖為1.576g，多糖純度為75%。

2.2 不同給藥途徑小鼠血清細胞因子的變化情況

本實驗檢測的24種細胞因子中包括：白細胞介素類：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17；干擾素類：IFN-γ；腫瘤壞死因子類：TNF-α；集落刺激因子類：G-C S F、G M-C S F；趨化因子類：Eotaxin、KC、MCP-1、IP-10、MIP-1α、RANTES、VEGF。

在灌胃組中，螺旋藻多糖口服后上調了Eotaxin、IFN-γ、IL-1 α、IL-1 β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12(p70)、IL-17、VEGF、TNF-α、G-CSF、KC的表達量，即給藥組被檢血清中的濃度高于對照組的濃度；IL-9、IL-13、IL-12(p40)、IL-10給藥組血清中細胞因子的濃度都低于對照組血清中細胞因子的濃度；而GM-CSF、IL-2、IP-10、RANTES、MCP-1、MIP-1α在給藥前后血清中細胞因子的濃度沒有明顯變化，在腹腔注射組中，24種細胞因子中只有3種細胞因子，即IL-9、VEGF、G-CSF在給藥后血清中的濃度低于對照組中的濃度，其余細胞因子在給藥后血清中的濃度都高于對照組血清中細胞因子的濃度。

在靜脈注射組中，靜脈注射螺旋藻多糖后，上調了Eotaxin、IFN-γ、IL-1 β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IP-10、RANTES、VEGF、KC、MCP-1、MIP-1α、TNF-α、G-CSF的表達量，即給藥組被檢血清中的濃度高于對照組的濃度；IL-3、IL-4、IL-9、IL-13、IL-12(p70)、IL-17在給藥后血清中細胞因子的濃度低于對照組中細胞因子的濃度，而GM-CSF、IL-1α、IL-12(p40)在給藥前后血清中細胞因子的濃度沒有變化。各種細胞因子的在給藥前后的變化總結見表1。

表1 各種細胞因子在給藥前后的變化情況Table 1 Effects ofSpirulina platensispolysaccharides administered by different routes on cytokine levels in mouse serum

2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析

在上述實驗結果的基礎上，對細胞因子總體變化量做了統(tǒng)計學分析，應用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件對實驗組及對照組進行配對t檢驗，根據(jù)P值進行顯著性分析，結果見表2。

從表2可以看出，在灌胃組中，IL-1α、IL-6實驗組和對照組血清中的濃度相比有極顯著差異(P＜0.01)，IL-1β、IL-17、TNF-α、VEGF濃度值有顯著差異(P＜0.05)；在腹腔注射組中，G-CSF、IL-10、IL-12(p40)、IP-10、KC、TNF-α實驗組和對照組血清中的濃度相比均有極顯著差異(P＜0.01)，IFN-γ、IL-6、IL-9、MCP-1、MIP-1α、RANTES濃度值有顯著差異(P＜0.05)；在靜脈注射組中，G-CSF的實驗組和對照組血清中的濃度相比具有極顯著差異(P＜0.01)，IL-3、IL-9、IL-12(p70)、IL-17、IP-10、MCP-1濃度值具有顯著差異(P＜0.05)。

表2 統(tǒng)計學T檢驗變化顯著的細胞因子Table 2 Statistically significant changes of serum cytokine levels in mice administeredSpirulina platensispolysaccharides by different routes in comparison with the control group

3 討 論

3.1 螺旋藻多糖不同作用途徑對細胞因子的影響

本實驗研究的3種給藥方式，即口服灌胃、腹腔注射和靜脈注射，不同給藥方式螺旋藻多糖對細胞因子的作用強度有所不同。其中，口服灌胃的給藥方式對細胞因子的影響較弱，其主要原因可能是劑量低，情況復雜，特別是經過胃酸處理和腸道微生物的作用，其含量和免疫刺激作用已經下降了很多[8]；腹腔注射組的給藥方式對細胞因子的影響較強，充分說明了黏膜系統(tǒng)在免疫調節(jié)中的重要作用；而靜脈注射組的給藥方式是避開腸胃道及黏膜系統(tǒng)直接進入血液作用于小鼠的，這種方式對細胞因子的影響居于兩者之間。本實驗的結果支持有關“腸黏膜系統(tǒng)是食品調節(jié)細胞因子網(wǎng)絡的最主要的系統(tǒng)[9]”的理論。

3.2 螺旋藻多糖對細胞因子的影響

細胞因子(cytokine)是一類由活化的免疫細胞(淋巴細胞、單核巨噬細胞)和相關細胞(纖維細胞、內皮細胞)等產生的具有調節(jié)細胞功能的高活性、多功能蛋白質多肽分子或糖蛋白，主要作為細胞間信號傳遞分子，介導和調節(jié)免疫應答及炎癥反應等。在天然免疫應答及獲得性免疫應答過程中，細胞因子表現(xiàn)出重要的調節(jié)功能。近年來為研究方便，從引起機體炎癥角度來把細胞因子分為兩大類：促進炎癥的細胞因子和抗炎癥的細胞因子。只有當炎癥細胞因子和抗炎細胞因子達到相對平衡，才能維持機體正常的免疫狀態(tài)、抗病和正常生理活動[10]。

本實驗結果表明，螺旋藻多糖對細胞因子是有調節(jié)作用的，總體表現(xiàn)出來的是促進免疫的作用。3種給藥方式小鼠的 IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥細胞因子都有不同程度的升高，說明螺旋藻多糖會刺激免疫細胞分泌炎癥細胞因子?？寡准毎蜃覫L-10腹腔注射和靜脈注射兩種給藥方式濃度升高，在灌胃方式給藥后濃度降低，這可能是由于螺旋藻多糖受胃中強酸環(huán)境和腸道堿性環(huán)境的影響，功能成分發(fā)生變化或者在腸道中被細菌利用造成的。抗炎細胞因子IL-13在灌胃和靜脈注射兩種方式給藥后濃度都降低，但是由于IL-13是由活化的T細胞分泌的，而小腸的固有層和上皮細胞就形成最大的單一的T細胞聚集單位，所以腹腔注射方式的IL-13升高[11]。

螺旋藻多糖可能正是通過這些細胞因子作為信號發(fā)揮免疫調節(jié)作用的，本實驗的結果支持有關“食品是通過細胞因子網(wǎng)絡來調節(jié)人類健康的”的理論[9]。

3.3 螺旋藻多糖對免疫系統(tǒng)可能的作用途徑

本研究表明，在灌胃組中，IL-1α、IL-6實驗組和對照組血清中的濃度相比有極顯著差異，說明灌胃方式的作用途徑可能是通過JAK/STAT信號通路，同時受到STAT3的調控[12]；在靜脈注射組中，G-CSF的濃度有極顯著變化，可能是激活了NF-κ B信號通路；而在腹腔注射組中，G-CSF、IL-10、IL-12(p40)、IP-10、KC、TNF-α實驗組和對照組血清中的濃度相比均有極顯著差異，說明腹腔注射作用的信號傳導途徑包括NF-κ B，MAPK，JAK/STAT 等[13-14]。

螺旋藻多糖經腹腸黏膜系統(tǒng)，它會與TLR2和TLR4結合形成化合物，然后刺激巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞激活一系列的信號傳遞，激活NF-κ B信號通路，啟動先天免疫系統(tǒng)，促進發(fā)炎細胞因子的合成與分泌，合成的細胞因子再作用于一些免疫細胞，如中性粒細胞、單核細胞、內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、N K細胞、細胞毒性T細胞、血小板、滑膜細胞等，形成一個復雜的免疫細胞之間的通訊網(wǎng)絡[15]。

總之，螺旋藻多糖作為一種無細胞毒性的免疫調節(jié)劑，能夠通過腸黏膜系統(tǒng)的受體相互作用，影響細胞因子的分泌，從而調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)并發(fā)揮其多種生理功能。本實驗的研究結果為其在功能性食品和其他一些領域的應用提供了參考，并為其發(fā)揮免疫調節(jié)作用的分子機制提供了實驗依據(jù)[16]。

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Spirulina platensisPolysaccharides Exert Immunoregulatory Effect through the Mucous Membranes of the Abdominal Cavity

CHANG Jing-yao，PANG Guang-chang*，LI Yang
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134, China)

R151.41

A

1002-6630(2010)17-0281-05

2010-07-06

國家自然科學基金項目(30871951)

常靜瑤(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：changjingyao128@163.com

*通信作者：龐廣昌(1956—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn