鴨腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的分離篩選

童 敏，潘道東*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

鴨腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的分離篩選

童 敏，潘道東*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

分離篩選鴨腸道內(nèi)產(chǎn)蛋白酶乳桿菌。利用脫脂乳培養(yǎng)基，從鴨消化道中分離篩選出兩株產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌，對(duì)菌體形態(tài)、染色反應(yīng)、培養(yǎng)性狀、生理生化性狀進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)合16S rRNA序列分析鑒定出篩選的乳酸菌為干酪乳桿菌鼠李糖亞種和干酪乳桿菌干酪亞種。

乳桿菌；產(chǎn)蛋白酶；分離；鑒定

Abstract：Two lactic acid bacterial stains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of duck with the aid of skim milk medium. The stains were identified asLactobacillus caseisubsp.,RhamnosusandLactobacillus caseithrough the systematic investigations of morphology, staining reaction, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequences analysis.

Key words：Lactobacillus；producing protease；screening；identification

對(duì)乳酸菌的分類(lèi)、鑒定，傳統(tǒng)的方法包括形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)及血清學(xué)反應(yīng)等。這種方法都存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不能進(jìn)行分型或鑒定到亞種，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合16S rRNA序列分析方法[2]，通過(guò)提取樣品中微生物的總DNA，從核酸水平對(duì)篩選的菌株進(jìn)行鑒定，

國(guó)內(nèi)外有較多報(bào)道從人、動(dòng)物的消化道中成功分離乳桿菌[3-4]，但從鴨腸中分離乳桿菌卻未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從鴨腸道中分離出兩株產(chǎn)蛋白酶乳桿菌，應(yīng)用16S rRNA基因序列擴(kuò)增方法進(jìn)行分子水平上的鑒定，為進(jìn)一步研究乳桿菌蛋白酶多態(tài)性選擇優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠頭鴨 市售。

TaqDNA聚合酶、dNTP MasterMix、10×PCR緩沖液、DL2000 DNAMarker 大連寶生物工程有限公司；電泳級(jí)瓊脂糖 BioBasic公司；6×DNA上樣緩沖液 Takara公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、SL乳桿菌選擇培養(yǎng)基[5]、生化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基[6](糖發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠、吲哚、硫化氫、耐酸、耐膽鹽實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基)。

1.3 儀器與設(shè)備

立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠(chǎng)；雙控電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Mastercycler梯度PCR儀 德國(guó)Eppendorf公司；紫外凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 乳桿菌初步篩選

殺死鴨子后，無(wú)菌取出內(nèi)臟，在無(wú)菌平皿內(nèi)分出盲腸、小腸。取黃豆大小的內(nèi)容物分別置于裝有生理鹽水的Eppendorf管中，10倍梯度稀釋成7個(gè)梯度，各取0.2mL涂布于MRS培養(yǎng)基上，采用燭缸法[7]，37℃培養(yǎng)48h。挑選白色、圓形、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、凸起的特征菌落，轉(zhuǎn)接種于SL乳桿菌選擇培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h。挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，挑選革蘭氏陽(yáng)性、鏡檢為桿狀的菌落作為待篩選菌株。

7) 修復(fù)后結(jié)構(gòu)增重小。復(fù)合材料補(bǔ)片密度較小，但力學(xué)性能優(yōu)越，有較高的比強(qiáng)度和比剛度。復(fù)合材料補(bǔ)片以更小的尺寸和更輕的質(zhì)量獲得與傳統(tǒng)金屬材料同等的修復(fù)效果。

1.4.2 產(chǎn)乳酸的鑒定

通過(guò)紙層析乳酸定性實(shí)驗(yàn)確定出產(chǎn)乳酸細(xì)菌。分別將可疑細(xì)菌移入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)12h，取10mL發(fā)酵液進(jìn)行離心，對(duì)上清液進(jìn)行紙層析。紙層析法[8]：新華1號(hào)濾紙，溶液系統(tǒng)為正丁醇、甲酸、水，其體積比為80:15:5，顯色劑為0.04g/100mL溴酚藍(lán)-乙醇溶液，0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為6.7，乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積分?jǐn)?shù)為2%，標(biāo)準(zhǔn)液、各菌株發(fā)酵液以毛細(xì)管點(diǎn)樣上行層析，顯色比較各斑點(diǎn)的Rf值[9]與標(biāo)準(zhǔn)乳酸的Rf*值。

1.4.3 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩

采用脫脂乳培養(yǎng)基[10]，梯度稀釋菌體進(jìn)行涂布，挑選產(chǎn)生水解圈的菌株作為目標(biāo)菌株。

1.4.4 生理生化鑒定

篩選出的目標(biāo)菌株通過(guò)過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、糖類(lèi)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、耐酸耐堿實(shí)驗(yàn)等[11]，從生理生化角度鑒定出所篩選菌株的種類(lèi)。

1.4.5 乳桿菌基因組DNA的制備

取10mL目標(biāo)菌株過(guò)夜培養(yǎng)物，在4℃、12000r/min離心收集菌體1mL，加入400μL STET(0.1mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、體積分?jǐn)?shù)5% Triton X-100 pH8.0)、10μL Lys，37℃保溫20min，加入等體積苯酚-異戊醇，12000r/min離心10.5min取上清，加等體積苯酚-異戊醇，12000r/min離心5min，取上清加入1/10醋酸鈉和1倍體積乙醇，混勻－20℃放置10min，12000r/min離心10min，棄上清加入0.5mL 75%乙醇溶液洗滌DNA沉淀，最后將DNA溶于50μL雙蒸水中，－20℃保存[12]。

1.4.6 16S rRNA的PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為滅菌三蒸水16μL、Buffer 2.5μL、Mg2+2.5μL、引物各0.5μL、DNA模板1μL、Taq酶0.2μL。引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。在凈化工作臺(tái)冰上操作，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸80s，循環(huán)30次；72℃延伸10min。

1.4.7 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析及純化

配制瓊脂糖凝膠，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6.5μL，加入溴酚藍(lán)指示劑，混勻后加樣。95V電泳30min，溴化乙錠染色20min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。切下目的條帶，回收純化，以進(jìn)行下一步的連接轉(zhuǎn)化。

1.4.8 構(gòu)建重組質(zhì)粒

將PCR產(chǎn)物回收后，與載體T18在4℃條件下過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物吸到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，溫和混勻，置于冰上30min。42℃熱休克90s，迅速放回冰中，將細(xì)胞冷卻1～2min后，加入800μL LB培養(yǎng)基，37℃、125r/min，搖蕩培養(yǎng)細(xì)菌45～90min。4000r/min離心1min，沉淀菌體，吸去上清液，留250μL左右轉(zhuǎn)化混合物鋪于LB瓊脂平板上(Amp+)，室溫下放置20～30min，待溶液完全被瓊脂吸收后，倒置平皿37℃培養(yǎng)12～16h。隨機(jī)挑取單菌落作PCR進(jìn)行初步檢測(cè)，并振蕩培養(yǎng)。

1.4.9 菌種鑒定和測(cè)序

將過(guò)夜振蕩培養(yǎng)的菌體送由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)定序列，測(cè)序結(jié)果用Blast法[13]鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌培養(yǎng)特征及形態(tài)特征

M RS培養(yǎng)基上，挑選菌落灰白色，扁平，表面光滑，邊緣較整齊的菌落繼續(xù)培養(yǎng)在SL培養(yǎng)基上，將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。淘汰球菌及鏈球菌，篩選出7株革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，桿狀的菌株劃斜面待進(jìn)一步鑒定。

2.2 產(chǎn)乳酸鑒定結(jié)果

初篩獲得的7株疑似菌株中有4株分別標(biāo)記為S1、S2、S7、M13經(jīng)過(guò)紙層析后斑點(diǎn)的Rf值與乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的Rf*值大致相同，確定為產(chǎn)乳酸菌株。其余3株菌株沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的斑點(diǎn)，則不視為目標(biāo)菌株。

2.3 產(chǎn)蛋白酶實(shí)驗(yàn)

經(jīng)脫脂乳培養(yǎng)基復(fù)篩后，得到S1、S2水解圈較為明顯，在梯度稀釋6倍后在培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈。S7沒(méi)有出現(xiàn)水解圈，則排除在篩選對(duì)象之外。M13水解能力很差，只有在沒(méi)有進(jìn)行梯度稀釋時(shí)有少量水解圈，故將其剔除。篩選出S1、S2兩株產(chǎn)蛋白酶乳桿菌進(jìn)行下一步鑒定，其菌體形態(tài)及水解圈見(jiàn)圖1、2。

圖1 菌株 S1、S2的菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of strains S1and S2

圖2 菌株稀釋10-6倍后在脫脂乳培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的水解圈Fig.2 Hydrolysis ring of diluted strains (10-6) on skim milk mediu

2.4 生理生化鑒定

表1 菌株S1、S2生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strains S1and S2

從表1可以看出，菌株S1、S2經(jīng)過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)均呈陰性。通過(guò)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]進(jìn)行比對(duì)，表明分離到的S1、S2菌株為乳桿菌。糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S1、S2均能利用果糖、半乳糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇，不能發(fā)酵棉籽糖、鼠李糖、木糖，初步鑒定為干酪乳桿菌，生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)16S rRNA測(cè)序結(jié)果提供佐證，結(jié)合兩者的結(jié)論使鑒定結(jié)果更為可信。

2.5 耐酸耐堿實(shí)驗(yàn)

從表2可以看出，S1可以在pH3.0～10.0生長(zhǎng)，在pH5.0～7.0生長(zhǎng)良好，而S2菌株對(duì)酸堿環(huán)境有更好的耐受能力，可以在pH2.5～11.0的環(huán)境中生長(zhǎng)。兩者對(duì)極端酸堿環(huán)境耐受能力均不強(qiáng)，適宜在pH5.0～7.0的環(huán)境中生長(zhǎng)。

表2 菌株S1、S2耐酸耐堿實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Acid-resistant and alkali-resistant tests of strains S1and S2

2.6 DNA的提取

所提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后在凝膠成像儀下觀察，顯示有明亮的條帶出現(xiàn)，表明S1、S2菌株基因組DNA提取成功，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株S1與S2基因組DNA電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis patterns of genomic DNA of strains S1and S2

2.7 目標(biāo)片段的擴(kuò)增

圖4 S1、S2菌株16S rRNA基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis patterns of PCR-amplified products of 16S rRNA of strains S1and S2

如圖4所示，分離得到乳酸菌，目標(biāo)片段擴(kuò)增結(jié)果均為3500bp左右，表明16S rRNA擴(kuò)增成功。

2.8 同源性比較分析

測(cè)序結(jié)果表明，從鴨腸中分離到的兩株產(chǎn)蛋白酶菌株的16S rRNA序列長(zhǎng)度分別為3486bp和3428bp，將該序列在GenBank上應(yīng)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的乳酸菌16S rRNA部分序列進(jìn)行同源性比較。發(fā)現(xiàn)所測(cè)得的S1序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的干酪乳桿菌鼠李糖亞種的16SrRNA序列進(jìn)行相似性比較，同源性為99%。S2序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的干酪乳桿菌干酪亞種16S rRNA序列進(jìn)行相似性比較，同源性為98%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從鴨腸中分離出兩株乳桿菌，兩者經(jīng)脫脂乳培養(yǎng)基鑒定都具有產(chǎn)蛋白酶的能力，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)均為陰性，結(jié)合革蘭氏染色鏡檢，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]確定S1、S2號(hào)菌株為乳桿菌；根據(jù)糖類(lèi)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并通過(guò)16S rRNA鑒定表明S1、S2號(hào)菌株分別為干酪乳桿菌鼠李糖亞種與干酪乳桿菌干酪亞種。

乳酸菌之所以有水解乳蛋白的能力，是因?yàn)槿樗峋嬖诘娜榈鞍姿庀到y(tǒng)將乳蛋白水解成多肽或氨基酸序列，不同的菌種所含有的蛋白酶種類(lèi)不同，對(duì)于乳蛋白的水解切點(diǎn)也不同，所水解的產(chǎn)物也具有各異的生理功能。有報(bào)道[14-15]稱(chēng)乳酸菌蛋白酶水解系統(tǒng)包括胞壁蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶、氨肽酶、pro-特異性肽酶等，胞壁蛋白酶首先把乳蛋白水解成一系列的短肽，然后由轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)輸至胞內(nèi)，再由胞內(nèi)肽酶進(jìn)一步將短肽水解成氨基酸或更小的肽段。可見(jiàn)，乳酸菌細(xì)胞壁蛋白酶在水解乳蛋白過(guò)程中占有非常重要的地位。本研究旨在篩選出產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌后，進(jìn)一步研究乳桿菌蛋白酶特別是胞壁蛋白酶的酶學(xué)特性及調(diào)控機(jī)制，以期了解乳桿菌胞壁蛋白酶的差異性與其發(fā)酵產(chǎn)品生理功能的關(guān)系，為進(jìn)一步定向選育優(yōu)良乳酸菌種提供參考。

[1] MANSO M A, LEONIL J, PIOT M, et al. Isolation and characterisation of aLactobacillus helveticusITG LH1 peptidase-rich sub-proteome[J].International Journal of Food Microbiology, 2005, 105(2):119-129.

[2] 杜曉華, 艾日登才次克, 李莉. 蒙古國(guó)地區(qū)酸乳中乳酸菌的鑒定及耐酸菌株篩選[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36(7):994-1000.

[3] SHIRO I, TAKESHI A, SAYAKA W, et al. Isolation of halotolerantLactococcus lactissubsp. lactis from intestinal tract of coastal fish[J].International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(1):116-121.

[4] 尹軍霞, 沈國(guó)娟, 鄒波, 等. 東北虎腸道降膽固醇雙歧桿菌的分離鑒定[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(5):205-208.

[5] 楊潔彬, 凌代文. 乳酸菌:生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用[M]. 北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1996.

[6] 趙斌, 何紹江. 微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2002.

[7] 伍時(shí)華, 黃翠姬, 石媛靖, 等. 酸乳菌種分離純化方法[J]. 食品科學(xué),2004, 25(10):162-166.

[8] 劉曉輝, 陳順, 高曉梅, 等. 酸菜中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究[J].中國(guó)釀造, 2009(2):62-64.

[9] 潘道東. 抗ACE活性之瑞士乳桿菌的篩選[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(2):145-148.

[10] 馮新忠, 王詠星, 范鎮(zhèn)明, 等. 額爾齊斯河野生丁腸道產(chǎn)蛋白酶菌株的初步鑒定及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(4):104-106.

[11] 張大為, 張潔, 丁成華. 嬰兒腸道內(nèi)嗜酸乳桿菌L2的篩選及菌株代謝產(chǎn)物的初步分析[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4):253-258.

[12] SAMBROOK J, RUSSEL D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 黃培堂, 譯.3版. 北京:科學(xué)出版社, 2002:87-105.

[13] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 8版. 北京:科學(xué)出版社, 1984.

[14] TERESA Z, ANNAMARIA R, EUGENIO P. Enzymatic activities of lactic acid bacteria isolated from Cornetto di Matera sourdoughs[J].International Journal of Food Microbiology, 2007, 115(2):165-172.

[15] NSEREKO V L, SMILEY B K, RUTHERFORD W M, et al. Influence of inoculating forage with lactic acid bacterial strains that produce ferulate esterase on ensilage and ruminal degradation of fiber[J]. Animal Feed Science and Technology, 2008, 145(1/4):122-135.

Isolation and Screening of Protease-producingLactobacilliin Duck Gastrointestinal Tract

TONG Min，PAN Dao-dong*
(College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Q93.331

A

1002-6630(2010)17-0197-04

2010-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972130)；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2009366)；國(guó)家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目(2009GB2C220412)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z357)

童敏(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：tongmin1106@126.com

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：daodongpan@163.com