普通小麥中一氧化氮相關(guān)因子(TaNOA)編碼基因的克隆和分子生物學(xué)分析

郝麗芳，余春梅，李斌，王道文

1 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101 2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049 3 南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 226007

普通小麥中一氧化氮相關(guān)因子(TaNOA)編碼基因的克隆和分子生物學(xué)分析

郝麗芳1,2*，余春梅1,3*，李斌1,2，王道文1

1 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101 2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049 3 南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 226007

一氧化氮是動植物體內(nèi)重要的信號分子。本研究利用同源克隆技術(shù)從六倍體普通小麥中獲得一個一氧化氮相關(guān)因子(TaNOA)編碼基因的全長基因組和cDNA克隆。該基因具有13個外顯子和12個內(nèi)含子，與擬南芥以及水稻中同源基因結(jié)構(gòu)相似。根據(jù)cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與擬南芥AtNOA1的序列一致性達60%以上，具備P-環(huán)GTPase G4-G5-G1-G2-G3的排列特征和保守的序列。對其中2個內(nèi)含子的測序分析表明在六倍體小麥中TaNOA至少有3個成員。進一步用中國春小麥缺體-四體材料將這3個TaNOA基因成員分別定位在第六同源群的6A、6B和6D染色體上，本研究中獲得的成員定位于6B染色體上，因此將其命名為TaNOA-B1。原生質(zhì)體表達實驗表明，TaNOA-B1可能定位在線粒體中。TaNOA基因在小麥根、葉片中表達較高，在幼穗和小花中有少量表達，莖中幾乎檢測不到表達。TaNOA的轉(zhuǎn)錄本水平還因脫落酸或鹽處理而上升，表明它可能參與小麥對非生物脅迫的反應(yīng)。本研究為進一步克隆六倍體小麥中TaNOA的其他成員及研究該基因在小麥中的功能奠定了基礎(chǔ)。

普通小麥，一氧化氮相關(guān)因子(NOA)，TaNOA1-B1，防御反應(yīng)

Abstract:Nitric oxide(NO)is an important signaling molecule with diverse physiological functions in both animal and plant cells.In this work, we isolated the full-length cDNA and genomic DNA sequences of TaNOA-B1 encoding a putative NO associated(NOA)factor in common wheat.Bioinformatic analysis showed that TaNOA-B1 possessed a similar intron/exon structure as its orthologous genes in Arabidopsis and rice.The amino acid sequence deduced from TaNOA-B1 was more than 60% identitical to those of Arabidopsis and rice NOA1 proteins.The primary structure of TaNOA-B1 contained the zinc finger and P-loop GTPase motifsconserved in Arabidopsis and rice NOA1 proteins.There existed at least three NOA gene members in common wheat, which were mapped to homoeologous group six chromosomes 6A, 6B and 6D, respectively.TaNOA-B1 investigated in this work was located on chromosome 6B.The transcripts of TaNOA members were found mainly in leaves.TaNOA-B1-GFP fusion protein may be located in mitochondria.TaNOA transcript level was up-regulated by abscisic acid(ABA)or NaCl treatments, indicating that TaNOA might be involved in wheat responses to abiotic stresses.

Keywords:common wheat, nitric oxide associated(NOA), TaNOA-B1, abiotic stress response

一氧化氮(Nitrite oxide，NO)作為重要的信號分子參與動物的神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉伸縮、激素分泌、細胞凋亡、離子通路活性以及免疫反應(yīng)等重要生理過程[1]。動物中內(nèi)源NO的合成主要是由一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)催化產(chǎn)生的。在NADPH作為電子供體和O2參與下，NOS將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物Nw-羥基-L-精氨酸，最終生成NO和L-瓜氨酸。該反應(yīng)需要核黃素二核苷酸(FAD)、核黃素單核苷酸(FMN)、四氫生物喋呤(BH4)等輔助因子的參與[1]。

植物中有關(guān) NO的發(fā)現(xiàn)和研究相對滯后。直到1998年Delledonne等[2]和Durner等[3]報道NO在植物防御反應(yīng)中作為重要的信號分子起作用，NO在植物中的研究才迅速展開。除了防御反應(yīng)外，NO還參與調(diào)控植物種子發(fā)芽、根系生長、維管束的分化、氣孔運動、開花和抗逆反應(yīng)等過程[4]。目前認為有兩種途徑參與植物內(nèi)源 NO的合成。一是通過硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)介導(dǎo)的還原途徑產(chǎn)生NO，但該酶產(chǎn)生NO的活性較低。二是認為植物細胞存在類似動物中的NOS參與的NO合成途徑[1,4]。一些生理生化分析(如檢測植物提取物中的NOS酶活性或外源施加NO的前體物質(zhì)硝普鈉檢測NO在植物中的積累)表明植物具備NOS酶活，存在類似動物細胞中的 NO合成途徑[1,4]。但直到Chandok等[5]和 Guo等[6]分別首次報道了煙草和擬南芥的NOS基因，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)水平上對植物 NOS基因的研究才有了突破。但擬南芥 NOS基因(AtNOS1)的突變體 Atrif1 對膦胺霉素(Fosmidomycin)抗性不能通過 NO 得到恢復(fù)[7]。Zemojtel等[8]分離了 AtNOS1在水稻(GenBank Accession No.Q6YPG5)和玉米(GenBank Accession No.AY110367)中的同源基因，并進行原核表達純化，體外生化分析卻沒有檢測到這些蛋白的NOS活性。因此，研究者認為AtNOS1可能并不直接合成NO，但鑒于Atnos1突變體中NOS的活性下降，NO含量降低等表型，Crawford等[9]將AtNOS1重新命名為 AtNOA1。Vardi等[10]研究硅藻Phaeodactylum tricornutum中與AtNOA1同源的基因PtNOA時也發(fā)現(xiàn)過量表達PtNOA的材料中，NO的水平是野生型的 1.8～2.4倍。Li等[11]研究表明，AtNOA1介導(dǎo)的NO合成參與Ca2+、G蛋白和H2O2信號通路調(diào)節(jié)擬南芥葉片氣孔的關(guān)閉。這些實驗表明，盡管AtNOA1及其同源基因不直接參與NO的合成，但確實影響植物體內(nèi)NO含量。進一步研究表明AtNOA1與枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis細菌中的YqeH蛋白同源，具有GTPase的活性，參與70S核糖體的組裝[12-14]。

由于NOA具有GTPase活性而且影響植物細胞中 NO的含量，研究其編碼基因的分子遺傳學(xué)有助于更深入地了解NOA發(fā)揮功能的機理。在作物中研究NOA，有利于揭示其是否參與重要農(nóng)藝性狀的調(diào)控，為作物遺傳改良研究提供信息。到目前為止，尚未見小麥中有關(guān)NOA基因的研究報道，本研究旨在鑒定和分離六倍體普通小麥中的NOA基因，了解其表達特征，并對其生物學(xué)功能做一些探討。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培品種小偃54，中國春缺體-四體系材料(總計21份)，六倍體小麥A組(烏拉爾圖小麥Triticum urartu，AA， 2n = 2x = 14，IE29-1)和D組(粗山羊草Aegilops tauschii，DD，2n = 2x = 14，As67和As91品系)祖先物種，四倍體硬粒小麥(T.turgidum ssp.durum，AABB，2n = 4x = 28，Langdon品種)，以上實驗材料均由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所植物細胞與染色體國家重點實驗室保存。

1.2 酶和試劑

LA DNA 聚合酶(含 GC buffer)，dNTPs，內(nèi)切酶和DNA marker購自大連寶生物公司。T載體購自Promega公司。膠回收試劑盒購自鼎國生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)公司。所用其他化學(xué)試劑均來自Amresco公司。

1.3 基因組DNA的提取

小偃54和中國春缺體-四體材料于25℃ 培養(yǎng)2周后，用CTAB方法[15]提取基因組總DNA(Genomic DNA，gDNA)。

1.4 RNA提取及cDNA的合成

在溫室(25℃)培養(yǎng)小偃 54，分別取 2周幼苗的根和葉片、孕穗期植株的莖和幼穗以及開花期植株的小花等材料。用 TRIzol?(Invitrogen公司)試劑，按試劑說明手冊制備總RNA?？俢DNA的合成按 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)反轉(zhuǎn)試劑盒說明書進行。

1.5 5′-RACE 和 3′-RACE

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一條小麥表達序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag，EST)，序列編號為BF201083(http://wheat.pw.usda.gov/wEST/)，與擬南芥NOA基因的編碼序列具有高度相似性。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計基因特異引物(未顯示)進行 5′-RACE和3′-RACE。5′-RACE 實驗按照 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)說明書進行。3′-RACE 操作按照 3′-Full Race Core Set(TaKaRa 公司)說明書進行。

1.6 TaNOA基因的克隆及其全長cDNA的獲得

根據(jù)1.5中獲得的序列設(shè)計了擴增TaNOA的全長引物P1和P2(表1)。分別以小麥葉片總的基因組DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，并進行T/A克隆。陽性克隆送Invitrogen公司測序。所得的克隆序列為2次獨立PCR和3個以上質(zhì)粒測序的結(jié)果。

1.7 普通小麥 NOA基因拷貝數(shù)的確定和染色體定位

根據(jù)測序結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)分析擬南芥、水稻和小麥等物種中NOA基因的結(jié)構(gòu)，設(shè)計了在水稻和小麥中保守的跨內(nèi)含子(Conserved and intron flanking，CIF，表1)引物分別擴增第3內(nèi)含子(內(nèi)含子長度在擬南芥、水稻和小麥間變化不明顯)和12內(nèi)含子(在上述3個物種間內(nèi)含子的長度變化較大)，且擴增產(chǎn)物的長度利于毛細管電泳(介于100～600 bp)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過T/A克隆后，陽性克隆隨機測序，根據(jù)片段的序列差異推斷普通小麥中NOA基因的拷貝數(shù)。PCR擴增反應(yīng)的模板為從小偃54、IE29-1、As67、As91、Langdon制備的基因組DNA樣品。熒光標(biāo)記引物CIF P3與P4配對，PCR產(chǎn)物經(jīng)過毛細管電泳分離，在中國春及其缺體-四體材料中對TaNOA基因進行染色體定位研究。

1.8 半定量PCR分析TaNOA的表達模式

設(shè)計保守引物TaNOA P3和P4，對TaNOA組織器官表達模式進行分析。內(nèi)參基因為普通小麥β-tubulin(GenBank Accession No.TAU76745)基因特異引物(表1)。

1.9 原生質(zhì)體表達載體的構(gòu)建和擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

通過PCR擴增、酶切回收和DNA連接將得到的TaNOA-B1基因的全長cDNA克隆到p163-GFP載體(含35S：GFP表達框[16])中GFP編碼序列的上游，制備了35S:TaNOA-B1-GFP表達載體，所用引物見表 1，經(jīng)測序驗證為正確的質(zhì)粒用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。溫室生長良好的擬南芥野生型(Columbia ecotype)葉片用于制備原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)化[17]。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體于Olympus FV500激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.10 脫落酸(ABA)和鹽處理

將常規(guī)培養(yǎng)的小麥種子萌發(fā) 3 d的幼苗轉(zhuǎn)入水培體系(改良的1/4 Hoaglands培養(yǎng)液)中。植株生長2周為二葉一心期時，對其進行相應(yīng)的脅迫處理。處理方法如下：將小麥幼苗分別移到含有20 μmol/L ABA 或 150 mmol/L NaCl 的新鮮 1/4 Hoaglands培養(yǎng)液中，處理4 h和10 h時分別取幼苗的地上部和地下部，液氮速凍后保存在?70°C冰箱備用?？俁NA提取、cDNA合成以及半定量RT-PCR試驗參照上述方法進行，所用PCR引物列于表1。

2 結(jié)果

2.1 TaNOA基因的cDNA和gDNA克隆以及基因結(jié)構(gòu)分析

通過生物信息學(xué)分析和分子克隆方法，在普通小麥品種小偃54中，獲得了一個具有全長編碼區(qū)的NOA基因的cDNA和基因組克隆。通過序列比對分析，所獲得的基因組克隆編碼區(qū)的序列與所獲得的cDNA克隆的序列是一致的，用該cDNA 5′特異序列的亞基因組表達模式分析表明，只在含有B亞基因組的四倍體和六倍體小麥中表達(結(jié)果未顯示)，結(jié)合2.2結(jié)果，將該基因命名為TaNOA-B1。比較擬南芥和水稻NOA以及TaNOA-B1的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)3個物種中NOA的結(jié)構(gòu)非常保守，均由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成(圖1A)?；蛟谖锓N間長度上的差異主要是內(nèi)含子長度上的變化。

TaNOA-B1與AtNOA1的序列一致性達到了61%，與OsNOA序列一致性達到了82%。進一步分析表明，TaNOA-B1具有典型的P-環(huán)GTPase酶的特點，即具有G4-G5-G1-G2-G3倒置排列的GTP結(jié)合基序(圖1B)[10,12-13,17]；在N端具有CX2CX25-35CX2C鋅指結(jié)合基序(圖1B)，表明 TaNOA-B1及其同源蛋白可能是一類能與核酸結(jié)合的蛋白。氨基酸序列顯示出的特征表明TaNOA-B1應(yīng)該具有生物學(xué)功能。

2.2 六倍體普通小麥 NOA基因拷貝數(shù)的分析和染色體定位

為了明確六倍體普通小麥中NOA基因的拷貝數(shù)，根據(jù)圖1A基因結(jié)構(gòu)的特點設(shè)計引物，利用PCR分別擴增跨NOA含內(nèi)含子-3(CIF P1和P2配對)和內(nèi)含子-12(CIF P3和P4配對)的區(qū)域，并進行測序分析(材料與方法1.7)。結(jié)果顯示小偃54中NOA基因intron-3和intron-12的序列均可分為3種類型(表2)。

對跨intron-12的3種序列分析表明，intron-12-1與A組供體材料IE29-1(序列結(jié)果未顯示)中擴增的序列一致，第2類序列(intron-12-2)與本研究所獲得的全長NOA的gDNA序列中內(nèi)含子-12一致(489 bp)，而第3類序列intron12-3與從D組供體材料(As67和As91)擴增的序列一致(結(jié)果未顯示)。利用跨內(nèi)含子12的熒光標(biāo)記的引物擴增A組供體烏拉爾圖小麥(T.urartu，IE29-1)，D組供體粗山羊草(Ae.Tauschii，As67和As91)，四倍體硬粒小麥(T.turgidum ssp.durum，Langdon)，結(jié)合毛細管電泳的方法對片段的類型進行分析。結(jié)果表明在二倍體供體物種(A和D組)、四倍體中分別有1種和2種片段(圖2A)。利用該引物擴增中國春及其缺體-四體材料，并進行片段分析。結(jié)果表明缺少6A、6B和6D染色體的材料中分別缺少了540 bp、489 bp和544 bp的條帶(圖2B)，而其余材料中的帶型與野生型中國春(CS)沒有區(qū)別(結(jié)果未顯示)。結(jié)合測序以及染色體定位結(jié)果，表明在六倍體小麥中，NOA有3個成員，分別位于6A、6B和6D染色體上，本研究中獲得的全長NOA序列來自6B染色體，因此將其命名為TaNOA-B1。

2.3 TaNOA的組織器官轉(zhuǎn)錄模式分析

根據(jù) TaNOA-B1以及 EST克隆(結(jié)果未顯示)的序列，設(shè)計保守引物擴增3個TaNOA成員(表1)，且為了避免基因組DNA污染，設(shè)計的引物擴增產(chǎn)生的PCR片段覆蓋了2個內(nèi)含子片段。從圖3中可以看出，TaNOA轉(zhuǎn)錄本水平在根和葉片中表達量比較高，在莖中幾乎檢測不到，在生殖器官(幼 穂 和花)中相對較低。

2.4 TaNOA-B1蛋白的亞細胞定位

圖1 擬南芥(AtNOA1)、水稻(OsNOA)和普通小麥(TaNOA-B1)NOA基因結(jié)構(gòu)以及氨基酸序列的多重比對分析Fig.1 Structure of Arabidopsis, rice, and common wheat NOA genes and the multiple alignment of the deduced amino acid sequences of three NOA proteins.(A)The structure of NOA genes from Arabidopsis(AtNOA), rice(OsNOA), and common wheat(TaNOA-B1).(B)Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of three plant NOA proteins.The conserved zinc finger motif(CX2CX25-35CX2C)is underlined.The sequence elements forming the conserved P-loop GTPase motif are boxed.Asterisks mark the presence of identical residues among the compared proteins.The conserved and semi-conserved substitutions are indicated by the symbols “:” and “.”, respectively.

為了研究 TaNOA-B1蛋白的亞細胞定位，構(gòu)建了其與 GFP的融合蛋白的表達框，轉(zhuǎn)化擬南芥葉片的原生質(zhì)體，通過這種瞬時表達體系獲得TaNOA-B1的亞細胞定位信息。從圖4A可以看出 TaNOA-B1-GFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中呈小點狀分布，而葉綠體呈較大的片狀分布(圖4B)，利用熒光顯微鏡同時觀察兩種熒光的圖像發(fā)現(xiàn)融合蛋白多分布在葉綠體的周圍，但兩者并不重合(圖 4D)。TaNOA-B1-GFP融合蛋白的這種分布特征與線粒體的定位非常相似。因此，TaNOA-B1-GFP融合蛋白不定位于葉綠體。根據(jù)線粒體的分布特征，推測TaNOA-B1很有可能定位在線粒體中。

圖2 祖先物種和六倍體小麥中NOA成員數(shù)以及其染色體定位分析Fig.2 NOA copy number in ancestral species of common wheat and chromosomal assignment of TaNOA genes in hexaploid wheat.The fragments specific for individual NOA gene members were amplified by PCR, followed by separation via capillary electrophoresis.NOA gene specific peaks are marked by arrows.The minor peaks labeled by asterisks are due to DNA size standards.The scale on the horizontal axis indicates fragment size(number of nucleotides), which was determined using the DNA size standards co-separated with the PCR products.The genotypes used in this analysis are provided in the brackets.The data shown are representative of five independent experiments.(A)Analysis of NOA copy number in the ancestral species(T.urartu, Ae.tauschii, T.turgidum ssp.durum)of common wheat by fragment analysis.(B)Chromosomal assignment of TaNOA genes in hexaploid wheat.The templates for PCR were prepared from Chinese Spring(CS), the nulli-tetrasomic(NT)lines of CS.Compared to the presence of all three NOA specific fragments in CS, the fragments were specifically absent from the NT lines lacking chromosomes 6A(N6AT6B),6B(N6BT6A), 6D(N6DT6A).The three NOA specific fragments were all amplified in the NT lines lacking other groups(i.e.1, 2, 3,4, 5 and 7)of chromosomes(data not shown).

2.5 對ABA和鹽處理的反應(yīng)

有研究表明在面臨外界的環(huán)境脅迫時，小麥中的NOS活性有被誘導(dǎo)上調(diào)的現(xiàn)象[18]，說明NOS可能參與了小麥對逆境的應(yīng)答反應(yīng)。為了明確本研究中分離的TaNOA基因成員是否參與小麥抗逆過程，對經(jīng)過20 μmol/L ABA或 150 mmol/L NaCl 處理的小麥幼苗中TaNOA基因轉(zhuǎn)錄本水平變化進行了分析(圖5)。在ABA處理條件下，TaNOA的轉(zhuǎn)錄本水平在地上和地下部分組織中都有比較明顯的上調(diào)。用150 mmol/L NaCl 處理10 h 后，其轉(zhuǎn)錄本略有升高。以上結(jié)果表明 TaNOA基因成員的轉(zhuǎn)錄本明顯地受 ABA處理誘導(dǎo)，鹽處理對其轉(zhuǎn)錄水平也有一定的上調(diào)作用。

表2 跨內(nèi)含子-3或內(nèi)含子-12 PCR片段的多態(tài)類型Table 2 Polymorphic types of the PCR fragments spanning introns-3 or introns-12

圖3 普通小麥中TaNOA成員在不同的器官中的轉(zhuǎn)錄模式分析Fig.3 Transcriptional pattern analysis of TaNOA in different organs of common wheat(T.aestivum).Transcripts were amplified using gene specific primers, with the PCR products separated using 1% agarose gel.Equal loading was maintained for all samples.The amplification of wheat tubulin transcripts served as an internal control.R: root; S: stem; L: leaf; YS: young spike; SP: spikelet.

3 討論

3.1 六倍體小麥基因組TaNOA成員數(shù)

小麥的基因組比較復(fù)雜，大約是水稻基因組的40倍，擬南芥基因組的100倍，基因組中有80%以上的重復(fù)序列[19-20]。對小麥基因組進行的大規(guī)模EST測序并對其中一些EST進行染色體定位，再通過與水稻、大麥、高梁以及短柄草等禾本科植物基因組的比較獲得小麥基因組基因分布、排序的規(guī)律，加深了研究者對小麥基因組的了解，為開展小麥基因組的研究奠定了基礎(chǔ)。由于目前尚無小麥全基因組序列信息，無法深入了解特定基因在基因組中分布和組成。本研究通過查詢小麥EST數(shù)據(jù)庫，獲得與水稻、擬南芥NOA1相似性很高的的小麥EST序列(BF201083)，在此基礎(chǔ)上通過分子生物學(xué)的手段獲得TaNOA-B1 cDNA及其對應(yīng)的基因組序列。比較TaNOA-B1和OsNOA(Os02g0104700)基因結(jié)構(gòu)，設(shè)計兩對保守的跨內(nèi)含子的引物，通過基因組 PCR、克隆和測序后的序列多態(tài)性分析(表 2)，確定了小麥基因組中至少存在3個NOA成員，結(jié)合基于毛細管電泳的片段分析將這3個成員定位在6A、6B和6D染色體上(圖2)。前人用BF201083做探針對六倍體小麥進行Southern雜交分析時發(fā)現(xiàn)3條雜交條帶，分別定位于 6AS、6DS染色體上(http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/westsql/map_locus.cgi?)。綜合前人與本論文的實驗結(jié)果，推測NOA在六倍體小麥中具有3個成員，分別定位于6A、6B和6D染色體上。

3.2 TaNOA-B1定位于線粒體

原生質(zhì)體瞬時表達試驗初步表明，TaNOA-B1-GFP融合蛋白的綠色熒光不與葉綠體的紅色信號重疊，表明TaNOA-B1-GFP融合蛋白不定位在葉綠體中。從其熒光信號的分布，推測可能是在線粒體中，但確切的分布尚需要進一步的實驗進行驗證。TaNOA-B1的同源蛋白PtNOA定位在葉綠體中[10]。Guo等[21]的實驗表明，AtNOA1-GFP融合蛋白定位于線粒體中。但 Flores-Pérez等[7]用 AtRIF-GFP轉(zhuǎn)化Atnos1的等位突變體Atrif1，發(fā)現(xiàn)GFP熒光定位在葉綠體中。目前報道的NOA定位試驗均是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行的，將來需要尋找能檢測野生型植物中NOA亞細胞定位的方法，以便確切地了解NOA發(fā)揮功能的部位。

圖4 TaNOA-B1-GFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of TaNOA-B1-GFP fusion protein.(A)GFP signal detected in the protoplast.(B)Background autofluorescence of chloroplasts.(C)Bright-field image of the same protoplast shown in(A)and(B).(D)A merged image of(A)and(B)showing the different localization patterns of TaNOA-B1-GFP fusion protein and chloroplasts.Bar = 10 μm.

圖5 在20 mmol/L ABA ABA和150 mmol/L NaCl分別處理4 h和10 h后TaNOA轉(zhuǎn)錄模式的分析Fig.5 Transcriptional pattern analysis of TaNOA genes in the wheat seedling treated with 20 mmol/ L ABA or 150 mmol /L NaCl after 4 h and 10 h.

3.3 TaNOA可能參與小麥對逆境的響應(yīng)

在ABA處理條件下，植物內(nèi)源的NO增加，促進氣孔的關(guān)閉，而氣孔的運動調(diào)節(jié)植物與外界的水分以及氣體交換[22]，影響植物內(nèi)部生理生化代謝。而在鹽脅迫條件下，內(nèi)源NO的變化，在不同的植物中有不同的結(jié)果。Zhao等[23]的研究結(jié)果表明，在鹽脅迫條件，擬南芥內(nèi)源的NO降低，NOS的活性下降。而Valderrama等[24]的研究表明，橄欖樹葉片在鹽脅迫條件下，NO和NOS的活性均上升。本實驗中，在ABA和NaCl處理時，TaNOA的轉(zhuǎn)錄水平均上升，是否意味著小麥葉片中的NO含量上升，并進而通過NO參與小麥對逆境的響應(yīng)，需要進一步的實驗進行驗證。

總之，本研究對普通小麥NOA成員的數(shù)目和染色體定位、表達模式以及其可能發(fā)揮的功能做了初步的探索，進一步的實驗尚需對其他兩個成員(TaNOA-A1和D1)進行克隆和研究，以便了解不同的成員是否在功能上有分化，相關(guān)實驗正在進行中。

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Molecular cloning and preliminary analysis of TaNOA in common wheat

Lifang Hao1,2*, Chunmei Yu1,3*, Bin Li1,2, and Daowen Wang1
1 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 School of Life Sciences, Nantong University, Nantong 226007, China

Received:September 22, 2009;Accepted:October 22, 2009

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB118300).

Corresponding author:Daowen Wang.Tel: +86-10-64889380; Fax: +86-10-64854467; E-mail: dwwang@genetics.ac.cn*These authors contributed equally to this study.國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973計劃)(No.2009CB118300)資助。