低水用量約束條件下的高固體含量纖維乙醇生物加工技術(shù)策略

張建，楚德強(qiáng)，于占春，張小希，鄧紅波，王修勝，朱智楠，張懷慶，戴干策，鮑杰

1 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2 中國(guó)石油吉林燃料乙醇有限公司，吉林 132101 3 華東理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院 化學(xué)工程聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

低水用量約束條件下的高固體含量纖維乙醇生物加工技術(shù)策略

張建1，楚德強(qiáng)1，于占春2，張小希2，鄧紅波2，王修勝1，朱智楠1，張懷慶1，戴干策3，鮑杰1

1 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2 中國(guó)石油吉林燃料乙醇有限公司，吉林 132101 3 華東理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院 化學(xué)工程聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

木質(zhì)纖維素原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)纖維乙醇需要使用大量的水和蒸汽，從而使過程能耗和廢水排放顯著增加，大幅度增加了加工成本。最大限度地降低水和蒸汽用量對(duì)過程節(jié)能和廢水減排并對(duì)最終成本控制極為重要。對(duì)極限低水用量約束條件下木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵路徑進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究和計(jì)算分析，確定了極低水和蒸汽用量的新型預(yù)處理技術(shù)，實(shí)現(xiàn)高效率預(yù)處理過程的廢水零排放；采用獨(dú)特的生物脫毒技術(shù)，用從自然界篩選的煤油霉菌Amorphotheca resinaeZN1對(duì)預(yù)處理原料中的抑制物進(jìn)行了快速生物脫毒；對(duì)極限高固體含量下高粘度多相流物系在復(fù)雜抑制物脅迫下的酶水解與發(fā)酵行為以及放大準(zhǔn)則進(jìn)行了研究；建立了基于Aspen plus平臺(tái)上的生物質(zhì)加工物性數(shù)據(jù)庫(kù)和嚴(yán)格熱力學(xué)意義上的全過程流程模擬數(shù)學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)過程的局部和全局設(shè)計(jì)與調(diào)優(yōu)。這一綜合技術(shù)在生物煉制微型工廠中進(jìn)行了測(cè)試，并在纖維素乙醇工業(yè)示范裝置中得到了應(yīng)用。該研究結(jié)果將為構(gòu)建具有工業(yè)實(shí)用價(jià)值的節(jié)能和清潔化木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù)提供依據(jù)。

木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化，極限低水用量策略，煤油霉菌，同步糖化與發(fā)酵，流程模擬

Abstract:The massive water and steam are consumed in the production of cellulose ethanol, which correspondingly results in the significant increase of energy cost, waster water discharge and production cost as well.In this study, the process strategy under extremely low water usage and high solids loading of corn stover was investigated experimentally and computationally.The novel pretreatment technology with zero waste water discharge was developed; in which a unique biodetoxification method using a kerosene fungus strainAmorphotheca resinaeZN1 to degrade the lignocellulose derived inhibitors was applied.With high solids loading of pretreated corn stover, high ethanol titer was achieved in the simultaneous saccharification and fermentation process, and the scale-up principles were studied.Furthermore, the flowsheet simulation of the whole process was carried out with the Aspen plus based physical database, and the integrated process developed was tested in the biorefinery mini-plant.Finally, the core technologies were applied in the cellulose ethanol demonstration plant, which paved a way for the establishment of an energy saving and environment friendly technology of lignocellulose biotransformation with industry application potential.

Keywords:lignocellulose bioconversion, extremely low-water-usage strategy,Amorphotheca resinaeZN1, simultaneous saccharification and ethanol fermentation, flowsheet simulation

木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)纖維乙醇需要進(jìn)行預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵等基本過程。以美國(guó)和中國(guó)為代表的超級(jí)農(nóng)業(yè)大國(guó)和超級(jí)生物質(zhì)生產(chǎn)大國(guó)，近年來在以纖維素乙醇為代表的木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù)上進(jìn)行了巨額投資，兩國(guó)都形成了 2015年前后完成產(chǎn)業(yè)化技術(shù)示范、2030年前后形成規(guī)模化纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)的共識(shí)[1-3]。目前纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)形成的主要障礙在于木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程的成本過高，具體體現(xiàn)在纖維素酶價(jià)格昂貴、木質(zhì)纖維素對(duì)乙醇收率低、預(yù)處理和精餾過程的能耗高、以及大量富含多種木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物的廢水處理所導(dǎo)致的環(huán)境成本[4-5]。在以往和正在進(jìn)行的研究中，大量注意力都放在了降低纖維素酶成本和提高乙醇收率的菌種等物耗所導(dǎo)致的成本問題上，而高能耗和廢水排放這類在大尺度過程上才得以充分顯現(xiàn)的工程問題則關(guān)注較少[6-8]。在工業(yè)示范工程實(shí)施之前，這類問題很難獲得實(shí)用的方案，甚至很難認(rèn)識(shí)到關(guān)鍵問題所在[9-10]。

從能耗角度進(jìn)行分析，木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程的能耗主要表現(xiàn)在預(yù)處理過程的蒸汽消耗和低濃度乙醇發(fā)酵液的提濃精餾能耗[4,11-14]。精餾能耗是工業(yè)生產(chǎn)中能耗最大的單元操作之一，一般占工廠總能耗的 50%～90%。乙醇精餾能耗與發(fā)酵液中的乙醇濃度關(guān)系顯著，乙醇濃度每一個(gè)百分點(diǎn)的提高都伴隨著精餾能耗的顯著降低[4]。達(dá)到較高乙醇濃度的先決條件是在生物轉(zhuǎn)化體系中加入盡可能高的木質(zhì)纖維素固體原料，從酶水解過程中獲得盡可能多的可發(fā)酵單糖，進(jìn)而在發(fā)酵后獲得較高的乙醇濃度[15]。然而，固體原料含量的提高會(huì)產(chǎn)生諸多生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和操作上的工程問題[11,14]。另一方面，當(dāng)從預(yù)處理的角度考慮能耗時(shí)，降低高溫蒸汽的用量是主要考慮因素。在保證預(yù)處理效率的前提下減少預(yù)處理高溫蒸汽的用量是減少預(yù)處理能耗的主要手段。

從降低廢水排放的角度分析，木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程的廢水排放主要出現(xiàn)在預(yù)處理廢水排放和發(fā)酵廢水排放兩個(gè)工序。目前世界上已經(jīng)或正在實(shí)施的纖維乙醇工業(yè)示范項(xiàng)目，預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素物料均需經(jīng)過一定形式的脫毒處理方可進(jìn)入后續(xù)的同步糖化與發(fā)酵工序，如水洗、過堿化調(diào)節(jié)(Overliming)、真空蒸發(fā)、活性炭/離子交換樹脂吸附、沉淀等手段，脫除預(yù)處理工段產(chǎn)生的大量復(fù)雜的抑制物組分，使得后續(xù)的同步糖化與發(fā)酵可以正常進(jìn)行[16-23]。這兩個(gè)步驟都伴隨著固液分離以及大量富含多種木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物和無機(jī)鹽成分的廢水的產(chǎn)生(15～25噸新鮮水/噸乙醇)。以最常用的稀酸預(yù)處理為例，預(yù)處理過程的固液比一般在1∶6～1∶10，即處理1 kg的固體原料，需要使用6～10 kg的稀酸溶液[24-25]。這不僅使過程水耗顯著增加，而且預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料含水量增加，使后續(xù)降低能耗為目標(biāo)的高固體含量同步糖化與發(fā)酵操作無法實(shí)施。另一個(gè)問題是水洗或過堿化處理中所必須涉及的固液分離只能在開放體系中進(jìn)行，由此產(chǎn)生的固體原料染菌問題極難避免[26]。

基于上述對(duì)工業(yè)示范實(shí)踐問題的觀察與思考，木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化過程中水和蒸汽的大量使用可以被認(rèn)為是最關(guān)鍵的技術(shù)障礙之一。在保證生物轉(zhuǎn)化過程收率和效率的前提下，最大限度地降低水和蒸汽的用量對(duì)過程節(jié)能和廢水減排具有極為重要的作用。本文從工程角度提出了一個(gè)應(yīng)對(duì)高能耗和廢水排放的極限低水用量的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)策略，主要內(nèi)容可以簡(jiǎn)述為：從第一步工序預(yù)處理在保證效率的前提下壓縮固液比至1∶1，即總水用量不超過木質(zhì)纖維素干固體質(zhì)量，預(yù)處理過程不產(chǎn)生任何廢水；第二步工序采用作者提出的獨(dú)特的煤油真菌Amorphotheca resinaeZN1生物脫毒技術(shù)，脫毒過程不使用任何耗水和耗能的操作，此過程不經(jīng)過固液分離直接進(jìn)入下一工序；第三步工序酶水解(糖化)與發(fā)酵過程采用極限高固體含量的同步糖化與發(fā)酵工藝，在低纖維素酶用量的條件下，以極低機(jī)械能耗獲得不低于8%(V/V)的高濃度乙醇發(fā)酵液。這一極限低水策略可以有效解決上述工業(yè)實(shí)踐中出現(xiàn)的問題：極限低水用量的預(yù)處理過程可以降低新鮮水和蒸汽用量的50%～80%以上，過程不產(chǎn)生任何廢水；預(yù)處理物料無需水洗、過堿化處理等高耗水處理工序，無需固液分離等引起染菌的操作；預(yù)處理物料直接進(jìn)行無需能耗和水耗的快速固體靜態(tài)生物脫毒，以脫除預(yù)處理過程產(chǎn)生的各種抑制物；生物脫毒后預(yù)處理物料無需進(jìn)行任何滅菌過程和脫水過程直接作為高固體含量同步糖化與發(fā)酵過程的原料；獨(dú)特的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)可以非常理想地適用于高固體含量的同步糖化與乙醇發(fā)酵過程，減少?gòu)U水排放，有效解決高粘度多相體系的混合與傳遞問題；高抗逆乙醇發(fā)酵菌種可以很好地適用于高抑制物體系。

這一基于極限低水用量的生物轉(zhuǎn)化策略已經(jīng)在作者建立的木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化微型工廠中進(jìn)行了測(cè)試，初步證明了這一策略的有效性。部分設(shè)想如適用于高固體含量的同步糖化與發(fā)酵生物反應(yīng)器等已經(jīng)在工業(yè)示范技術(shù)中進(jìn)行了應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米秸稈與纖維素酶

實(shí)驗(yàn)中所用玉米秸稈來自吉林，2007年秋收獲。經(jīng)過粗切、清洗、除塵、烘干，并經(jīng)過直徑為10 mm的圓孔篩進(jìn)行篩分后，裝入塑料防潮袋中備用。

實(shí)驗(yàn)中所用纖維素酶為 Accellerase1000(購(gòu)自杰能科國(guó)際有限公司，Genencor International)，纖維素酶活和纖維二糖酶活分別為 65.8 FPU/mL和152.0 IU/mL。

1.1.2 菌種

生物脫毒所用菌種Amorphotheca resinaeZN1為本實(shí)驗(yàn)室從自然界分離純化得到。高抗逆乙醇發(fā)酵菌種Saccharomyces cerevisiaeDQ1為本實(shí)驗(yàn)室誘變選育得到。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 L，煮沸l(wèi) h，用8層紗布過濾，然后補(bǔ)水至1 L，并添加葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，pH自然。

合成培養(yǎng)基：KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，酵母粉 1.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，pH自然，分裝于三角瓶中20 mL/100 mL。

25%和50%的水解液培養(yǎng)基：將在30%(W/W)固體含量條件酶解得到的水解液與合成培養(yǎng)基分別以1∶3和1∶1(V/V)的比例混合，pH調(diào)整至5.0，即可分別得到25%和50%的水解液培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中20 mL/100 mL。

種子培養(yǎng)基：成分同50%的水解液。

上述培養(yǎng)基經(jīng)過115℃、20 min滅菌后備用。

此外，在進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵操作時(shí)，發(fā)酵體系中營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度為：KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，酵母粉 1.0 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 預(yù)處理反應(yīng)器

預(yù)處理反應(yīng)器為自行設(shè)計(jì)和制造。主要由蒸汽發(fā)生器、高壓反應(yīng)釜和儲(chǔ)料倉(cāng) 3部分組成。蒸汽發(fā)生器工作壓力為 3.0 MPa；高壓反應(yīng)釜設(shè)計(jì)容積為15 L，最多可裝填干基秸稈800 g；高壓蒸汽由反應(yīng)釜底部經(jīng)分散器噴射進(jìn)入反應(yīng)釜，與稀酸預(yù)浸后的玉米秸稈直接接觸。反應(yīng)釜內(nèi)溫度以及外壁溫度分別由熱電偶監(jiān)測(cè)。

1.2.2 同步糖化與發(fā)酵生物反應(yīng)器

適合于高固體含量同步糖化與發(fā)酵的生物反應(yīng)器為自行設(shè)計(jì)，詳細(xì)結(jié)構(gòu)參見文獻(xiàn)[12]。反應(yīng)器內(nèi)部容積為 5 L，攪拌槳為正螺旋螺帶槳、渦輪/翼型攪拌槳和底槳，正螺旋螺帶槳通過支撐桿固定在攪拌軸上，并自上而下盤旋在攪拌軸周邊；渦輪/翼型攪拌槳設(shè)置于正螺旋螺帶槳形成的框體內(nèi)，固定在正螺旋螺帶槳的上下兩個(gè)端部之間的攪拌軸上；底槳固定在攪拌軸的底端，緊貼罐體底部。同時(shí)，反應(yīng)器上安裝有功率測(cè)定儀，可以監(jiān)測(cè)攪拌槳的實(shí)時(shí)功耗變化。

1.2.3 生物脫毒反應(yīng)器

生物脫毒反應(yīng)器為5 L培養(yǎng)箱，安裝有控溫和控濕設(shè)備。

1.3 方法

1.3.1 極限低水用量的高溫稀酸預(yù)處理及效果評(píng)價(jià)

稱取一定量干基玉米秸稈，按一定的液固比加入不同濃度的稀 H2SO4溶液，預(yù)浸一定時(shí)間。將預(yù)浸好的秸稈裝填入預(yù)處理反應(yīng)器進(jìn)行預(yù)處理，溫度160℃～200℃，壓力 1.0～1.6 MPa，保溫 3～15 min。預(yù)處理物料不經(jīng)水洗直接在0.1 mol/L、pH為4.8的檸檬酸緩沖液體系中進(jìn)行糖化評(píng)價(jià)；固體含量5.0%(W/W)，內(nèi)含60 μg的四環(huán)素和80 μg的放線菌酮；加酶量為15.0 FPU/g DM，于50℃、180 r/min的恒溫水浴搖床上酶解72 h。每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，酶解結(jié)束后取樣分析。

1.3.2 預(yù)處理秸稈的生物脫毒

從Amorphotheca resinaeZN1斜面接一環(huán)孢子于PDA斜面培養(yǎng)基，25℃靜置培養(yǎng)3 d后，用20 mL無菌水將斜面上的孢子洗出，接入盛有 200 g稀酸預(yù)處理后且pH調(diào)整至6.0的玉米秸稈的生物脫毒反應(yīng)器中，維持25℃、60%的濕度進(jìn)行脫毒共培養(yǎng)3 d。脫毒后將物料保存于?20℃冰箱中待用。

1.3.3 同步糖化與發(fā)酵

同步糖化與發(fā)酵過程根據(jù)溫度的不同分為 2個(gè)階段，即預(yù)酶解階段和同步糖化與發(fā)酵階段。預(yù)酶解階段的條件為50℃、150 r/min，以15 FPU/g DM加入所需纖維素酶，再以補(bǔ)料的方式加入稀酸預(yù)處理后的秸稈，至固體含量達(dá)到 30%(W/W)。完成預(yù)酶解之后，調(diào)整反應(yīng)器溫度至37℃、pH 5.0，以10%(V/V)的接種量接入馴化后的酵母種子液，同步糖化與發(fā)酵階段開始。該階段持續(xù)48 h或60 h。每隔6 h取樣，10 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行HPLC分析。

30%固體含量水解液的制備同同步糖化與發(fā)酵過程中預(yù)酶解階段操作，酶解持續(xù)48 h。然后8 000 r/min離心10 min，收集上清液即得到30%固體含量的水解液。

1.3.4 分析方法

玉米秸稈組分分析：玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量由Foss 2021纖維素分析儀(Foss A/S，丹麥)測(cè)定。原始秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量分別為32.6%、26.4%和8.1%。秸稈中含水量的測(cè)定是將樣品置于 105℃烘箱中烘 12 h至恒重，通過差重法計(jì)算其含水量。

預(yù)處理后玉米秸稈中水不溶性固體含量(Water insoluble solids，WIS)的測(cè)定：稱取一定量的預(yù)處理后的玉米秸稈，以10∶1(V/W)的比例加入去離子水，室溫下振蕩混合2 h，用砂芯漏斗抽濾，然后重復(fù)上述步驟，直至濾液中葡萄糖濃度低于0.1 g/L，將固體收集后烘干至恒重，利用差重法計(jì)算WIS。

葡萄糖、木糖、乙醇及抑制物濃度分析：葡萄糖、木糖、乙醇、乙酸、乙酰丙酸、糠醛及羥甲基糠醛通過高效液相色譜儀測(cè)定。條件為：Bio-Rad HPX-87H柱，流動(dòng)相為 5 mmol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，柱溫65℃，示差折光檢測(cè)器(RID-10A)監(jiān)測(cè)，樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂尣⒂?.22 μm的濾膜過濾，進(jìn)樣量為20 μL。

葡萄糖得率和木糖得率：葡萄糖得率和木糖得率的計(jì)算參照美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室的 LAP-008(2001)的方法[27]。

螺帶槳反應(yīng)器內(nèi)流型分布模擬：采用計(jì)算流體力學(xué)軟件CFX 11.0(ANSYS Inc.)對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的流型分布進(jìn)行模擬。反應(yīng)器內(nèi)的流體簡(jiǎn)化為均一的液體模型，其粘度為10 Pa·s(與實(shí)際物系粘度相當(dāng))，攪拌槳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 極限低水用量的稀酸預(yù)處理

一般預(yù)處理過程的固液比一般在1∶6～1∶10，即處理1 kg的固體原料，需要使用6～10 kg的稀酸溶液[24-25]。木質(zhì)纖維素原料由于其固有的高度吸水特性，即使含水率高于90%時(shí)，原料狀態(tài)仍呈現(xiàn)為分散狀的小顆粒固體。這使得在低水用量的預(yù)處理過程中，木質(zhì)纖維素固體原料、稀酸液體、高溫蒸汽三相之間的傳熱、傳質(zhì)和混合成為影響預(yù)處理效率的關(guān)鍵因素。

本文對(duì)不同預(yù)浸狀態(tài)下稀硫酸濃度、固液比(稀硫酸與干基秸稈質(zhì)量之比)、溫度、時(shí)間、原料裝量、蒸汽壓力的變化對(duì)預(yù)處理過程中能耗、水耗及預(yù)處理后秸稈酶解效果的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。表 1列出了預(yù)浸固液比及預(yù)處理時(shí)裝料量對(duì)預(yù)處理過程的影響。從表 1可以看出，隨著預(yù)浸時(shí)固液比從 2/1降低到1/2，預(yù)處理蒸汽用量從41.9 g/100 g DM增到59.1 g/100 g DM，增加了41.1%；水耗(包括新鮮水和蒸汽冷凝水)增加近 3倍，預(yù)處理后秸稈固體含量從50.1%降至26.5%，而預(yù)處理后秸稈的酶解性能基本沒有變化(葡萄糖得率穩(wěn)定在 85%左右，木糖得率有所提高)。同時(shí)，降低預(yù)處理時(shí)的裝料量(從800 g到400 g)，隨之帶來的是蒸汽用量加倍，水耗增加了將近50%，預(yù)處理后物料的固體含量也有大幅下降(從50.1%降低到37.7%)，而秸稈的酶解性能沒有明顯變化。從表 1中也可以看出，延長(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間可以提高秸稈的預(yù)處理效果，但伴隨著預(yù)處理過程能耗和水耗的增加。

表1 不同稀酸預(yù)處理?xiàng)l件下蒸汽用量、水用量及預(yù)處理秸稈的酶解效果Table 1 Effect of different pretreatment conditions on the steam and water usage and enzymatic hydrolysis

從上述分析可知，影響預(yù)處理原料酶水解效率的主要因素除了在以往大量研究中認(rèn)知的稀酸濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以外，原料預(yù)浸時(shí)的液固比和原料在預(yù)處理時(shí)反應(yīng)器內(nèi)的裝填量也是影響預(yù)處理酶水解效率、水耗和能耗的主要因素。預(yù)浸時(shí)固液比的降低對(duì)預(yù)處理效率的影響有限，但對(duì)預(yù)處理用水量的降低影響明顯，因?yàn)轭A(yù)浸固液比的降低與預(yù)處理所用蒸汽的增加并不存在線性關(guān)系。換言之，預(yù)處理固液比的顯著降低在對(duì)預(yù)處理效率改變不明顯的情況下，僅導(dǎo)致了蒸汽用量的有限增加。另一個(gè)影響預(yù)處理效率的因素是預(yù)處理反應(yīng)器的原料裝填量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)增大預(yù)處理反應(yīng)器的原料裝填量時(shí)，預(yù)處理效率基本不變，而蒸汽消耗則大量降低，從而顯著降低了過程的能耗和水耗。原因可能是由于秸稈原料的強(qiáng)大和快速的吸水能力，使預(yù)處理原料吸收蒸汽的速率快于反應(yīng)器內(nèi)蒸汽冷凝的速率。當(dāng)預(yù)處理反應(yīng)器滿載時(shí)，進(jìn)入的蒸汽大部分用于加熱秸稈，即大部分消耗的蒸汽都是有效蒸汽；而當(dāng)反應(yīng)釜裝料量較少時(shí)，則造成了較多蒸汽的自然冷凝而形成無效蒸汽。使用本文所述預(yù)處理反應(yīng)器，選擇 100%固體原料裝填率，預(yù)浸固液比為 2/1，預(yù)浸稀硫酸濃度為2.5%，190℃維持3 min，在維持相同或相近的預(yù)處理效率的結(jié)果的同時(shí)，新鮮水用量和蒸汽用量比目前典型的稀酸預(yù)處理技術(shù)指標(biāo)大量降低，稀酸用量與固體原料比率不超過0.5∶1，消耗蒸汽與固體原料比率不超過0.5∶1，即預(yù)處理全過程的液固比不超過 1∶1，最終獲得的預(yù)處理原料含水率不超過50%，實(shí)現(xiàn)預(yù)處理過程稀酸廢水的零排放。

2.2 預(yù)處理后木質(zhì)纖維素的生物脫毒與水洗脫毒

預(yù)處理過程中木質(zhì)纖維素發(fā)生部分降解，產(chǎn)生包括有機(jī)酸類(乙酸、甲酸、乙酰丙酸)、呋喃類(糠醛、羥甲基糠醛)、酚類化合物(香蘭素、對(duì)羥甲基苯甲醛)等在內(nèi)的各種類型的降解產(chǎn)物，對(duì)后續(xù)的酶水解和乙醇發(fā)酵菌種形成強(qiáng)抑制作用。有效脫除預(yù)處理原料所含的抑制物(即“脫毒”)是生物轉(zhuǎn)化過程中一個(gè)必需的步驟。我們從自然界分離篩選到3株能夠快速代謝預(yù)處理后秸稈中抑制物的霉菌(分別命名為 ZN1、ZN2、ZN3)，其菌落形態(tài)如圖1所示。對(duì)3株菌進(jìn)行了16S rDNA分子生物學(xué)鑒定和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比較后確定的結(jié)果表明，3株霉菌分別屬于Amorphotheca resinae、Penicillium polonicum、Penicillium turbatum。脫毒能力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，Amorphotheca resinaeZN1可代謝的抑制物種類和脫毒時(shí)間較另外兩株菌更有優(yōu)勢(shì)，所以在生物脫毒實(shí)驗(yàn)中選取菌株Amorphotheca resinaeZN1。

對(duì)稀酸預(yù)處理后的玉米秸稈原料進(jìn)行水洗脫毒和生物脫毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 2。從表 2可以看出，隨著水洗時(shí)用水量的增加，秸稈中的抑制物濃度有明顯的減少，但可發(fā)酵單糖也隨之流失。而使用A.resinaeZN1進(jìn)行2 d生物脫毒后，秸稈中的抑制物明顯減少，單糖雖然有少量消耗，但是纖維素的含量基本沒有變化，原料固體含量穩(wěn)定在40%左右，能夠與后續(xù)的高固體含量同步糖化與發(fā)酵工藝很好的銜接起來。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，典型的稀酸預(yù)處理玉米秸稈在1～3 d的A.resinaeZN1生物脫毒后，秸稈物料不經(jīng)過滅菌步驟直接進(jìn)入同步糖化與發(fā)酵生物反應(yīng)器進(jìn)行高固體含量操作。

表2 稀酸預(yù)處理玉米秸稈進(jìn)行不同脫毒后秸稈中成分變化Table 2 The composition variations in corn stover after different detoxification methods

2.3 高固體含量下高粘度體系的同步糖化(酶水解)與發(fā)酵

在高固體含量條件下，木質(zhì)纖維素酶水解形成的液-固兩相體系具有極高的粘度和非牛頓流體特征，并依預(yù)處理強(qiáng)度不同含有不同濃度的有機(jī)酸、呋喃、苯酚類降解產(chǎn)物。在進(jìn)入同步糖化與發(fā)酵階段后，發(fā)酵產(chǎn)生的CO2氣體與原有的液-固兩相形成一個(gè)類似于氣溶膠形式的高粘度氣-液-固多相復(fù)雜體系，傳質(zhì)、傳熱、酶反應(yīng)、細(xì)胞活性、氣體釋放等行為都受到極大的抑制。這一復(fù)雜的體系中酶水解和發(fā)酵的行為表征、類氣溶膠體系抑制的解除是過程強(qiáng)化的關(guān)鍵因素。

本文結(jié)合高固體含量玉米秸稈同步糖化與發(fā)酵過程中粘度的變化、固體含量的變化、CO2溢出速率的變化規(guī)律等特征參數(shù)研發(fā)了一種新型的能夠處理高固體含量、高粘度含氣泡復(fù)雜體系的新型螺帶槳反應(yīng)器[12]。同時(shí)，利用計(jì)算流體力學(xué)(CFD)軟件對(duì)螺帶槳反應(yīng)器中的流型分布進(jìn)行了模擬(圖2)。從圖2可以看出，在高粘度的同步糖化與發(fā)酵體系中，物流在整個(gè)反應(yīng)器內(nèi)形成了一個(gè)大的循環(huán)，即隨著螺帶槳的旋轉(zhuǎn)，底部物料順著螺帶的方向從反應(yīng)器外周盤旋而上，到達(dá)螺帶的頂部后沿著攪拌軸落下；同時(shí)，反應(yīng)器內(nèi)也形成了無數(shù)的小循環(huán)，即在螺帶與罐壁的交界處部分物料形成了二次繞流，這也是反應(yīng)器中剪切最強(qiáng)的部位，它們促進(jìn)了整個(gè)反應(yīng)體系的混合與傳質(zhì)[12]。

圖3表示經(jīng)過不同脫毒處理的玉米秸稈在同步糖化與發(fā)酵過程中，葡萄糖的消耗和乙醇的生成情況。從圖3可以看出，沒有經(jīng)過脫毒處理的玉米秸稈由于抑制物的大量存在，嚴(yán)重影響了纖維素酶的催化活力，導(dǎo)致預(yù)酶解結(jié)束時(shí)體系中的葡萄糖濃度僅為 47.4 g/L，遠(yuǎn)低于經(jīng)過脫毒處理體系的60 g/L左右。同時(shí)，抑制物的存在也影響了酵母菌的正常生長(zhǎng)和乙醇代謝過程，發(fā)酵結(jié)束體系的乙醇濃度僅為7.8 g/L。隨著水洗時(shí)用水量的增加，秸稈中的抑制物濃度逐漸降低，酵母菌的延滯期明顯縮短，葡萄糖的消耗速率和乙醇的生成速率明顯加快。而經(jīng)過生物脫毒的玉米秸稈其葡萄糖消耗速率和乙醇生成速率與1倍水洗脫毒的效果相當(dāng)，發(fā)酵結(jié)束體系中乙醇濃度能達(dá)到41 g/L左右的水平。

圖1 霉菌的不同菌落形態(tài)Fig.1 The different phenotypes of mold colonies.

圖2 螺帶槳反應(yīng)器中的流型分布Fig.2 The fluid flow distribution in the helical bioreactor.

圖3 不同脫毒方法對(duì)玉米秸稈高固體含量 SSF性能的影響Fig.3 The effect of different detoxification methods on the SSF performances of high solids loading corn stover.

2.4 基于Aspen plus平臺(tái)的木質(zhì)纖維素物性數(shù)據(jù)庫(kù)和過程全流程數(shù)學(xué)模擬

圖4 基于Aspen plus平臺(tái)建立的年產(chǎn)3 000噸纖維乙醇數(shù)學(xué)模型Fig.4 The established simulation model for 3 000 ton/year cellulosic ethanol production flow chart based on Aspen plus technology.

本文在Aspen plus流程模擬平臺(tái)上構(gòu)建了從木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇的全流程數(shù)學(xué)模型(圖4)。嚴(yán)格熱力學(xué)基礎(chǔ)上的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)物性數(shù)據(jù)庫(kù)，包括標(biāo)量常數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)、飽和蒸汽壓數(shù)據(jù)庫(kù)、汽化熱數(shù)據(jù)庫(kù)、固體摩爾體積數(shù)據(jù)庫(kù)、理想氣體熱容數(shù)據(jù)庫(kù)、固體熱容數(shù)據(jù)庫(kù)、液相熱容數(shù)據(jù)庫(kù)等。模擬系統(tǒng)對(duì)基于3 000 噸/年玉米秸稈生產(chǎn)燃料乙醇工業(yè)示范項(xiàng)目流程進(jìn)行了嚴(yán)格的流程模擬。數(shù)學(xué)模型包括34個(gè)單元操作設(shè)備，75股物流，26種組分。操作方式采用擬穩(wěn)態(tài)方法，并與實(shí)際過程的半連續(xù)方法實(shí)現(xiàn)了等價(jià)匹配。對(duì)涉及的26種生物質(zhì)組分初步建立了生物質(zhì)模擬用物性數(shù)據(jù)庫(kù)。物性模型采用了嚴(yán)格的熱力學(xué)方法模型。對(duì)全流程進(jìn)行了案例計(jì)算，對(duì)過程參數(shù)進(jìn)行全局調(diào)優(yōu)。模擬計(jì)算結(jié)果已經(jīng)用于工業(yè)示范項(xiàng)目的物料平衡和熱量平衡計(jì)算。

對(duì)不同預(yù)處理原料進(jìn)行案例計(jì)算的結(jié)果(表 3)表明，降低預(yù)處理時(shí)的固液比，同時(shí)采用高固體含量SSF工藝，盡管乙醇生產(chǎn)效率和后續(xù)分離的能耗不變，但新鮮水用量和污水產(chǎn)量都隨之增加；如果在高固液比(2/1)的條件下進(jìn)行預(yù)處理，而降低SSF過程的固體含量，盡管沒有污水產(chǎn)生，但是用于條件SSF工藝固體含量的新鮮用水量逐步增加，更為嚴(yán)重的是，乙醇的生產(chǎn)效率大幅降低，蒸餾單位重量的乙醇所消耗的能量也大幅度提高。因此，這再次證明了我們開發(fā)的高固液比預(yù)處理、固態(tài)生物脫毒和高固含量SSF工藝是節(jié)水、零污染、乙醇產(chǎn)率高且分離能耗低的環(huán)境友好型工藝。

2.5 生物煉制微型工廠平臺(tái)以及工業(yè)示范應(yīng)用

本文所提出的極限低水用量約束下的高固體含量纖維乙醇生物加工技術(shù)策略在生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物煉制微型工廠公共平臺(tái)進(jìn)行了測(cè)試。圖5是微型工廠的流程示意簡(jiǎn)圖。微型工廠以典型的農(nóng)作物秸稈為原料，經(jīng)過一套生物轉(zhuǎn)化的完整流程，日產(chǎn)1 kg燃料乙醇；同時(shí)利用乙醇發(fā)酵產(chǎn)生的CO2，經(jīng)過第二套生物轉(zhuǎn)化流程日產(chǎn)1 kg琥珀酸。微型工廠平臺(tái)共包括原料倉(cāng)儲(chǔ)區(qū)/原料罐區(qū)、前處理工段、預(yù)處理工段、同步糖化與乙醇發(fā)酵工段、琥珀酸發(fā)酵工段、產(chǎn)品提純工段等6個(gè)主要工段。

這一策略的主要內(nèi)容在中石油3 000 噸/年玉米秸稈生產(chǎn)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目得到了應(yīng)用。該工業(yè)示范項(xiàng)目由國(guó)家發(fā)改委和中石油投資，由吉林燃料乙醇有限公司實(shí)施，是一套嚴(yán)格意義上的纖維乙醇工業(yè)示范裝置，計(jì)劃于 2010年開工，2010年底完工并試車。本文所述的糖化與發(fā)酵技術(shù)、全流程物料與熱量衡算等已經(jīng)在該裝置上得到了應(yīng)用。

3 結(jié)論

從木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)纖維乙醇需要使用大量的水和蒸汽，從而使過程能耗和廢水排放顯著增加。最大限度地降低水和蒸汽的用量對(duì)過程的節(jié)能和廢水減排極為重要。本文從纖維素乙醇工業(yè)示范的實(shí)踐中提煉出了一個(gè)極限低水策略，從工程角度對(duì)水和蒸汽用量進(jìn)行了嚴(yán)格控制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)極限低水用量約束下的木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵路徑進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究和計(jì)算分析，對(duì)極限低水和極限低蒸汽用量下的影響酶水解效率、能耗、水耗的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究，確定了最適的預(yù)處理工藝技術(shù)；采用獨(dú)特的生物脫毒技術(shù)，用作者從自然界篩選的煤油霉菌Amorphotheca resinaeZN1對(duì)預(yù)處理原料中的抑制物進(jìn)行了快速的生物脫毒；對(duì)極限高固體含量下高粘度多相流物系在復(fù)雜抑制物脅迫下的酶水解與發(fā)酵行為以及放大準(zhǔn)則進(jìn)行研究。這一綜合技術(shù)在作者建立的生物煉制微型工廠中進(jìn)行了測(cè)試并已在纖維素乙醇工業(yè)示范裝置中得到了應(yīng)用。本文所提出的技術(shù)思路將為構(gòu)建具有工業(yè)實(shí)用價(jià)值的節(jié)能和清潔化木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù)提供依據(jù)。

表3 利用Aspen plus模擬不同預(yù)處理固液比條件的纖維乙醇生產(chǎn)案例計(jì)算Table 3 Case simulation of cellulosic ethanol production under different S/L ratio during pretreatment process with Aspen plus

圖5 生物反應(yīng)器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物煉制微型工廠流程圖Fig.5 The flow chart of mini-plant for biorefinery in state key laboratory of bioreactor engineering.

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Process strategy for ethanol production from lignocellulose feedstock under extremely low water usage and high solids loading conditions

Jian Zhang1, Deqiang Chu1, Zhanchun Yu2, Xiaoxi Zhang2, Hongbo Deng2, Xiusheng Wang1,Zhinan Zhu1, Huaiqing Zhang1, Gance Dai3, and Jie Bao1
1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2 Jilin Fuel Ethanol Co., PetroChina, Jilin 132101, China 3 State Key Laboratory of Chemical Engineering, School of Chemical Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Received:May 23, 2010;Accepted:June 28, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.20976051), Ministry of Education of China(No.20090074110013), Fundamental Research Funds for the Central Universities, Shanghai Leading Academic Discipline Project(No.B505), China National Special Fund for State Key Laboratory of Bioreactor Engineering(No.2060204).

Corresponding author:Jie Bao.Tel: +86-21-64251799; E-mail: jbao@ecust.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20976051)，教育部博士點(diǎn)基金(No.20090074110013)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金，上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(No.B505)，科技部生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)基金(No.2060204)資助。