發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中廢棄細(xì)胞的循環(huán)利用

白雪飛，陳可泉，葉貴子，黃秀梅，李建，姜岷

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，南京 210009

發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中廢棄細(xì)胞的循環(huán)利用

白雪飛，陳可泉，葉貴子，黃秀梅，李建，姜岷

南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，南京 210009

對厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸后的廢棄細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，考察了以細(xì)胞水解液作為有機(jī)氮源重新用于丁二酸發(fā)酵的可行性。比較了超聲破碎、鹽溶、酶解 3種方法破碎細(xì)胞獲得的水解液作為氮源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的效果，結(jié)果表明酶解制得的細(xì)胞水解液效果最佳。以總氮含量為1.11 g/L的酶解液(相當(dāng)于10 g/L酵母膏)作為氮源發(fā)酵，丁二酸產(chǎn)量可達(dá)42.0 g/L，繼續(xù)增大酶解液用量對耗糖、產(chǎn)酸能力沒有顯著提高。將細(xì)胞酶解液與5 g/L酵母膏聯(lián)用發(fā)酵36 h后，丁二酸產(chǎn)量達(dá)75.5 g/L，且丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度為2.10 g/(L·h)，比使用10 g/L酵母膏時提高了66.7%。因此，厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸結(jié)束后的廢棄細(xì)胞酶解液可以替代原培養(yǎng)基中50%的酵母膏用于發(fā)酵。

廢棄細(xì)胞，酶水解，氮源，丁二酸

Abstract:Spent cells recovered from anaerobic fermentation byActinobacillus succinogeneswere used as nitrogen source for succinic acid production.Three methods were investigated for cell wall-breaking.The results showed that enzymatic hydrolysis was more effective for higher succinic acid yield.When the enzymatic hydrolysate of spent cells was added to reach a total nitrogen concentration 1.11 g/L(equivalent to 10 g/L yeast extract), the succinic acid concentration was 42.0 g/L, but it increased slightly when enhancing the level of enzymatic hydrolysate.However, when 5 g/L yeast extract was supplemented with the enzymatic hydrolysate of spent cells, the succinic acid concentration reached 75.5 g/L after 36 hours and, the succinic acid productivity was 2.10 g/(L·h), which increased by 66.7% compared with the fermentation using 10 g/L yeast extract.Therefore, enzymatic hydrolysate of spent cells could replace 50% yeast extract in the original medium for succinic acid production.

Keywords:recycle spent cells, enzymatic hydrolysis, nitrogen source, succinic acid

微生物細(xì)胞作為一個有機(jī)體，其胞內(nèi)含有豐富的氨基酸、維生素及其他微量元素[1-2]。發(fā)酵生產(chǎn)中，微生物細(xì)胞在發(fā)酵結(jié)束后常常被作為廢棄物而丟棄，造成環(huán)境污染以及資源浪費。因此，將廢棄細(xì)胞作為營養(yǎng)源重新利用具有重要的意義。York等[3]以廢酵母細(xì)胞自溶液為氮源，補加營養(yǎng)鹽和維生素后用于乙醇的生產(chǎn)，其乙醇產(chǎn)量與以蛋白胨為氮源時相當(dāng)，達(dá)到46 g/L；Marco等[4]研究了酵母細(xì)胞自溶液在乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用，證明了酵母細(xì)胞自溶液能夠為乙醇的生產(chǎn)提供必要的氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)，使乙醇產(chǎn)量達(dá)到12%(V/V)。Gao等[5-6]以鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus細(xì)胞水解液作為氮源用于乳酸的發(fā)酵時可以使原培養(yǎng)基中酵母膏用量減少20%，乳酸產(chǎn)量達(dá)到80 g/L；Amrane[7]在考察乳酸桿菌自溶液用于乳酸發(fā)酵的效果時，乳酸產(chǎn)量最高達(dá)到38 g/L，與2 g/L酵母膏的發(fā)酵產(chǎn)乳酸能力相當(dāng)。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸與化學(xué)法相比，具有利用可再生資源、固定 CO2等優(yōu)點，近年來備受矚目。在眾多的丁二酸生產(chǎn)菌株中，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes具有高產(chǎn)丁二酸、耐高底物、產(chǎn)物濃度、可以利用廣泛碳源等優(yōu)點，已成為目前具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)丁二酸能力的菌株之一[8]。然而，A.succinogenes培養(yǎng)過程中通常需要添加酵母膏等營養(yǎng)源用于菌體生長與產(chǎn)酸[9]，這些營養(yǎng)成分價格昂貴，無法適應(yīng)丁二酸工業(yè)化生產(chǎn)的需求。本文將丁二酸發(fā)酵后的廢棄細(xì)胞制得的水解液替代培養(yǎng)基中部分氮源重新用于丁二酸發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 菌種

Actinobacillus succinogenesNJ113(CGMCC No.1716)為本實驗室篩選并保藏。1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10.0，酵母膏 5.0，NaHCO310.0，NaH2PO49.6，K2HPO415.5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：富馬酸二鈉 1.0，KH2PO43.0，MgCl2·6H2O 0.3，CaCl20.3，NaCl 1.0，酵母膏10.0 g/L或含有相應(yīng)總氮質(zhì)量的廢棄細(xì)胞水解液，一定濃度葡萄糖分消后加入，加入與葡萄糖等質(zhì)量的MgCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵pH。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清瓶培養(yǎng)

將A.succinogenes接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的血清瓶(血清瓶容積100 mL)中進(jìn)行活化培養(yǎng)10 h后，按5%接種量將種子液接于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶(血清瓶容積100 mL)中，37℃下200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.3.2 3L發(fā)酵罐培養(yǎng)

3 L發(fā)酵罐(BIOFLO 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)裝有1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基。接種量5%，培養(yǎng)溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，CO2流速0.3 L/min，發(fā)酵至葡萄糖不再消耗。

1.3.3 細(xì)胞的破碎方法

將丁二酸發(fā)酵結(jié)束后的細(xì)胞離心收集，用蒸餾水洗滌2次之后配制成60 g/L的菌懸液。采用超聲波、自溶和酶水解 3種方法對菌懸液進(jìn)行處理。超聲破碎法[4]：將菌懸液在150 W的功率下超聲處理20 min；自溶法[3]：向菌懸液中加入1%(W/V)NaCl和6%(W/V)無水乙醇，50℃水浴處理24 h；酶水解法：將菌懸液在pH 8.0，55℃下采用堿性蛋白酶(活力2.4 AU/g)水解24 h，其中酶添加量為3.45 μL/g干細(xì)胞。3種方法分別處理后得到的水解液在8 000 r/min下離心15 min，得到上清液即為所需的細(xì)胞水解液，測定其中氨基氮Amino nitrogen(AN)、總氮Total nitrogen(TN)含量后用于配制培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基中需添加總氮含量大于2.22 g/L的酶解液時，先將酶解液濃縮1倍后再用于配制培養(yǎng)基。

1.3.4 分析方法

葡萄糖濃度由生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測定，菌體生長以紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)測定波長660 nm處吸光值(OD660)表示，AN、TN含量分別用甲醛滴定法[10]和凱氏定氮法測定[11]，丁二酸含量采用 HPLC(美國戴安公司)法測定[12]，丁二酸收率(%)=[丁二酸產(chǎn)量(g/L)/葡萄糖消耗量(g/L)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞水解液的制備及用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

分別采用超聲波、自溶和酶水解 3種不同的方法對丁二酸發(fā)酵結(jié)束后的細(xì)胞進(jìn)行破碎，通過測定水解液中氨基氮及總氮含量，考察 3種方法的破壁效果，結(jié)果見表1。

表1 3種細(xì)胞破碎法對水解液中AN含量及水解度的影響Table 1 Effects of three kinds of cell disruption on the AN content and AN/TN ratio in the hydrolysate

由表 1可知，酶水解液 Enzymatic hydrolysate(EH)中AN含量和水解度(AN/TN)最高，其次是超聲破碎法制得的水解液 Ultrasonic hydrolysate(UH)，自溶法制得水解液Autolysate(AS)中AN的含量僅為酶水解液的一半左右。

在葡萄糖濃度 20 g/L及相同總氮添加量條件下，考察 3種水解液分別作為氮源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的效果。由圖1可知，當(dāng)EH作為氮源時，丁二酸產(chǎn)量與菌體生長量較高，而UH和AS作為氮源時發(fā)酵效果較差，且菌體幾乎不能利用 AS作為氮源發(fā)酵產(chǎn)丁二酸。雖然 EH與 UH在氨基氮含量、水解度方面相差不大，但其發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的能力卻相差甚遠(yuǎn)，利用EH作為氮源時丁二酸產(chǎn)量是采用UH的8倍。文獻(xiàn)報道，在利用超聲波破碎細(xì)胞時，超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活[13]，從而有可能影響了 UH用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的效果；自溶雖然是一種比較經(jīng)濟(jì)的細(xì)胞破壁方法，但存在水解收率低、水解液中殘余鹽濃度高等缺點[1]，且高濃度的Na+以及乙醇對A.succinogenes的生長代謝均有抑制作用[14]。因此，本研究選擇酶解法制備細(xì)胞水解液作為氮源用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸。

圖1 利用不同水解液制備丁二酸的結(jié)果對比Fig.1 Succinic acid production from different hydrolysates.UH: ultrasonic hydrolysate; AS: autolysate; EH: enzymatic hydrolysate.

2.2 酶解液作為有機(jī)氮源用于發(fā)酵制備丁二酸

在葡萄糖濃度100 g/L，不同總氮添加量的條件下考察酵母膏(YE)和酶解液分別作為氮源對于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母膏和酶解液分別作為氮源發(fā)酵制備丁二酸Fig.2 Succinic acid production with yeast extract and EH separately as nitrogen source.(A)Fermentation with yeast extract.(B)Fermentation with EH.

以4 g/L、5 g/L、6 g/L、10 g/L與16 g/L的酵母膏作為氮源時，其總氮含量分別如圖2A橫坐標(biāo)所示。隨總氮含量的增加，丁二酸產(chǎn)量增勢較為明顯，當(dāng)酵母膏的添加量從TN含量0.55 g/L增加到1.11 g/L時，葡萄糖消耗從48 g/L增加到85 g/L，丁二酸產(chǎn)量增加了0.95倍。而以酶解液作為氮源時，圖2B所示，隨著TN含量從0.55 g/L增加至1.11 g/L，葡萄糖的消耗量增加了約 30 g/L，丁二酸產(chǎn)量提高了 3倍，而繼續(xù)增加酶解液用量對丁二酸產(chǎn)量幾乎沒有影響。在TN含量均為1.11 g/L時，菌體生長量相當(dāng)，然而酶解液用于發(fā)酵的丁二酸產(chǎn)量達(dá)36.5 g/L，僅為以酵母膏為氮源時丁二酸產(chǎn)量的一半左右，說明酶解液無法完全替代酵母膏用于丁二酸的制備。文獻(xiàn)報道，在乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，當(dāng)采用一些廉價的氮源替代時通常也難以完全達(dá)到酵母膏的發(fā)酵特性，只能部分取代酵母膏，因此需要添加一定量酵母膏作為氮源用于菌體生長與產(chǎn)乳酸[15]。在前期研究中采用啤酒酵母水解液替代酵母膏時，雖然啤酒酵母水解液在添加混合維生素的基礎(chǔ)上能替代酵母膏用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，但生產(chǎn)強(qiáng)度仍然較低。因此，本文考慮在酶解液中添加其他氮源用于丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)。

2.3 復(fù)合氮源對發(fā)酵制備丁二酸的影響

在葡萄糖濃度為100 g/L的條件下，向TN含量為1.11 g/L(與10 g/L酵母膏TN含量相等)酶解液中分別添加不同量的酵母膏、玉米漿(CSL)，考察對發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響。由表2可知，向酶解液中添加15 g/L CSL后，丁二酸產(chǎn)量只增加了17.2%。而在酶解液中添加3 g/L YE后，丁二酸產(chǎn)量增加了66.9%；添加5 g/L YE以后，丁二酸產(chǎn)量增加了1倍左右，且丁二酸收率達(dá)到最大為80.7%，與10 g/L YE發(fā)酵時丁二酸產(chǎn)量相當(dāng)(圖2)。

2.4 利用復(fù)合氮源在3 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵制備丁二酸

在3 L發(fā)酵罐中，分別考察不同氮源對丁二酸發(fā)酵的影響，結(jié)果圖3所示。單獨以酶解液作為氮源發(fā)酵時，葡萄糖消耗速率及產(chǎn)酸速率較慢，OD值僅為8.0，發(fā)酵結(jié)束時殘?zhí)菫?7 g/L，丁二酸產(chǎn)量達(dá)42.0 g/L。當(dāng)在酶解液中添加 5 g/L酵母膏后，OD值高達(dá)14，發(fā)酵36 h葡萄糖耗盡，丁二酸產(chǎn)量達(dá)到75.5 g/L，發(fā)酵效果與以10 g/L酵母膏作為氮源時的結(jié)果相當(dāng)，且丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到2.10 g/(L·h)，比單獨采用酵母膏、酶解液發(fā)酵的生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了66.7%和140%。因此，細(xì)胞酶解液在補加5 g/L YE后可以完全替代10 g/L酵母膏用于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，可使原培養(yǎng)基中酵母膏的用量減少50%。在原培養(yǎng)基中氮源所占原料成本的比例約 47.5%，而采用酶解液添加 5 g/L酵母膏作為氮源時其所占原料成本的比例降低為31.8%。

表2 不同氮源組成對發(fā)酵制備丁二酸的影響Table 2 Effects of supplementation of nitrogen sources with EH on succinic acid production

圖3 不同氮源發(fā)酵制備丁二酸Fig.3 Succinic acid production with different nitrogen source.(A)Fermentation with 10 g/L YE.(B)Fermentation with EH.(C)Fermentation with EH supplemented with 5 g/L YE.

3 結(jié)論

分別采用超聲破碎、鹽溶和酶水解 3種方法制備細(xì)胞水解液，其中酶解制備的水解液用于發(fā)酵制備丁二酸的效果最佳。

在葡萄糖濃度為100 g/L的條件下，添加TN含量為1.11 g/L的酶解液時，丁二酸產(chǎn)量可達(dá)36.5 g/L，然而繼續(xù)增加酶解液用量對丁二酸產(chǎn)量增加不顯著；在TN含量1.11 g/L酶解液中添加5 g/L酵母膏后，丁二酸產(chǎn)量提高102.8%，丁二酸收率高達(dá)80.7%。

復(fù)合氮源的3 L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)丁二酸實驗結(jié)果表明，酶解液可以替代原培養(yǎng)基中50%的酵母膏用于發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，且丁二酸生產(chǎn)強(qiáng)度比采用原培養(yǎng)基時提高了 66.7%，使氮源成本在原料成本中所占的比例由原來的47.5%降低至31.8%。

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Recycle of spent cells from anaerobic succinate fermentation

Xuefei Bai, Kequan Chen, Guizi Ye, Xiumei Huang, Jian Li, and Min Jiang
State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China

Received:March 1, 2010;Accepted:June 22, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB724701), National Natural Science Foundation of China(No.20606017), State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, “Qinglan Project” of Jiangsu Province.

Corresponding author:Min Jiang.Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-83172075; E-mail: jiangmin@njut.edu.cn國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2009CB724701)，國家自然科學(xué)基金(No.20606017)，材料化學(xué)工程國家重點實驗室基金，江蘇省“青藍(lán)工程”資助。