清毒祛癆丸的薄層色譜鑒別及沒食子酸的含量測(cè)定

楊榮艷，王倩，劉曉秋，華會(huì)明*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009；3.四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000）

清毒祛癆丸的薄層色譜鑒別及沒食子酸的含量測(cè)定

楊榮艷1，3，王倩2，劉曉秋1，華會(huì)明1*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009；3.四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000）

目的：建立清毒祛癆丸的鑒別和含量測(cè)定方法。方法：用TLC對(duì)玄參、黃芪、連翹、地榆進(jìn)行鑒別；用HPLC測(cè)定沒食子酸的含量。結(jié)果：薄層鑒別斑點(diǎn)清晰；沒食子酸平均加樣回收率為98.7%，RSD＝1.2%。結(jié)論：鑒別重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于清毒祛癆丸的質(zhì)量控制。

清毒祛癆丸；TLC鑒別；HPLC測(cè)定；沒食子酸

清毒祛癆丸是四平結(jié)核病醫(yī)院多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，由地榆、黃芪、玄參、連翹、桔梗等20味藥組成，用于治療各型肺結(jié)核，淋巴結(jié)核，結(jié)核胸膜炎，腹膜炎，腦膜炎，腎結(jié)核，骨結(jié)核等結(jié)核病。該丸劑是水蜜丸，臨床療效顯著。但目前尚缺乏有效的質(zhì)量控制方法，為了有效控制清毒祛癆丸的質(zhì)量，保證其臨床療效，本文采用TLC對(duì)方中具有抑菌解毒、治癆殺蟲、利水滲濕、排膿生肌、補(bǔ)氣生津功效的藥材玄參、地榆、黃芪、連翹進(jìn)行鑒別，獲得滿意結(jié)果；沒食子酸是地榆的指標(biāo)性成分，具有抗菌、抗病毒、抗真菌作用，并有抗炎癥、抗腫瘤、抗過敏、抗誘變的作用，因 《中國(guó)藥典》2005版沒有收載HPLC測(cè)定地榆中沒食子酸的含量，所以本文建立了HPLC測(cè)定制劑中沒食子酸的含量，結(jié)果表明方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010AHT型高效液相色譜儀（島津）；CLASSVP色譜工作站；UV-260可見-紫外分光光度計(jì)；紫外檢測(cè)器，AE240電子分析天平；LC-250超聲清洗器，功率250W，頻率50kHZ；純水器（德國(guó)）。

1.2 試藥

清 毒 祛 癆 丸 （批 號(hào) 20090901，20090902，20090903，四平結(jié)核病醫(yī)院提供）。沒食子酸對(duì)照品（批號(hào) 110831-200302）、哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)111730-200604）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào) 110821-200609）、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)0781-200311）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，市售硅膠G板（上海盛亞化工有限公司，批號(hào)20090306），D101型大孔樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20090107）。

乙腈、甲醇均為色譜純（天津康科德科技有限公司），其他試劑均為分析純。水為實(shí)驗(yàn)室自制的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 玄參的鑒別 取本品25g，研細(xì)，加甲醇50mL，浸泡1h后，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5mL，微熱使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次30mL，棄去乙醚液，再用醋酸乙酯振搖提取3次，每次30mL，棄去醋酸乙酯液，繼續(xù)用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取哈巴俄苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例，同法制備缺玄參陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（16∶4∶1）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照不干擾測(cè)定，見圖1。

2.1.2 黃芪的鑒別 取本品22g，研細(xì)，加甲醇60mL，回流提取3h，提取液蒸干，加水30mL，使溶解，用水飽和乙醚液提取4次，每次30mL，棄去乙醚液，用水飽和正丁醇提取3次，每次30mL，合并提取液，回收正丁醇液至干，殘?jiān)铀?mL使溶解，上已處理好的 D101型大孔吸附樹脂柱（長(zhǎng)16cm，內(nèi)徑1.5cm），以水100mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇140mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇180mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀柡驼〈?0mL使溶解，用正丁醇飽和氨試液提取3次，每次30mL，棄去，再用正丁醇飽和水30mL提取2次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例，同法制備缺黃芪的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖2。

圖1 清毒祛癆丸中玄參TLC圖

圖2 清毒祛癆丸中黃芪TLC圖

2.1.3 連翹的鑒別 取本品24g，研細(xì)，加石油醚（30～60℃）50mL，密塞，超聲處理15min，濾過，棄去石油醚，殘?jiān)鼡]干，加甲醇50mL，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5mL微熱使溶解，加醋酸乙酯振搖提取3次，每次30mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇5mL使溶解，通過D101型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5cm，柱高10cm），用30%乙醇50mL洗脫，棄去洗液，再用稀乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取連翹苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例，同法制備缺連翹陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（17∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖3。

2.1.4 地榆的鑒別 取本品24g，研細(xì)，加水100mL，煮沸30min，放冷，離心10min，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，每次30mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方比例，同法制備缺地榆陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各5μL，對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯（水飽和）-醋酸乙酯-甲酸（6∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖4。

圖3 清毒祛癆丸中連翹TLC圖

圖4 清毒祛癆丸中地榆TLC圖

2.2 沒食子酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（1∶99），流速：1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：272nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)P2O5干燥12h后的沒食子酸對(duì)照品適量，加水制成10μg·mL－1的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%鹽酸溶液20mL，加熱回流3h，放冷，濾過，濾液置100mL量瓶中，用水適量分?jǐn)?shù)次洗滌容器和殘?jiān)匆簽V入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性制劑及陰性對(duì)照液的制備 按處方組成比例制備缺地榆陰性制劑，再按供試品溶液的制備方法，制備地榆陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在選定的色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果沒食子酸與其相鄰峰之間分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05，陰性樣品不干擾測(cè)定。理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算均不低于8 000，HPLC圖見圖5。

圖5 清毒祛癆丸HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 取沒食子酸對(duì)照品約10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.1，0.3，0.5，0.8，1.0，1.5mL至10mL量瓶中，分別加水至刻度，搖勻，制成沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液。分別精密吸取上述溶液各10μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，以沒食子酸峰面積Y對(duì)濃度X（μg·mL－1）回歸分析，得回歸方程：Y＝3.2×104X+1 430.1，r＝0.999 9，結(jié)果表明沒食子酸在2.12～31.8μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，室溫放置，于0，3，6，9，12h分別進(jìn)樣，按上述色譜條件分析，記錄沒食子酸峰面積，計(jì)算RSD＝1.4%。表明沒食子酸樣品溶液至少在12h內(nèi)基本穩(wěn)定穩(wěn)定。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取沒食子酸對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD＝0.8%。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品（批號(hào)20090901）6份，照 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算RSD＝1.5%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗(yàn) 取己知含量的本品粉末（批號(hào)20090901）6份，每份約1g，精密稱定，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按 “2.2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表1。

表1 沒食子酸加樣回收率試驗(yàn)

2.2.11 樣品的測(cè)定 按供試品制備方法，每批樣品制備兩份，測(cè)定沒食子酸的含量，結(jié)果20090901，20090902，20090903批清毒祛癆丸中沒食子酸含量分別為 0.192，0.215，0.176 mg·g－1。

3 討論

清毒祛癆丸為中藥大復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，各成分之間干擾較嚴(yán)重，通過多次試驗(yàn)篩選出合理的供試品溶液制備方法和色譜分離系統(tǒng)，對(duì)其中主要藥味玄參、黃芪、連翹、地榆進(jìn)行鑒別，并對(duì)地榆中的沒食子酸進(jìn)行含量測(cè)定，經(jīng)過3批樣品測(cè)定表明，該方法簡(jiǎn)便易行，薄層色譜斑點(diǎn)分離清晰，重現(xiàn)性好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，可以作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

3.1 薄層色譜條件考察

3.1.1 玄參 在玄參的薄層色譜鑒別中，參照了《中國(guó)藥典》（2005年版）的薄層色譜條件［1］，在供試品處理步驟中增加了用乙醚和醋酸乙酯萃取過程，以除去一些脂溶性成分的干擾，并增加水飽和的正丁醇提取，以凈化供試品溶液，試驗(yàn)結(jié)果斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾。

3.1.2 黃芪 在黃芪的薄層色譜鑒別中，參照了《中國(guó)藥典》（2005年版）［2］，但供試品處理步驟中改用大孔吸附樹脂柱代替 《中國(guó)藥典》記載的中性氧化鋁柱，又考察以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液、氯仿-甲醇-正丁醇-水（2∶1∶4∶2）10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，結(jié)果前者薄層效果優(yōu)于后者，薄層斑點(diǎn)更加清晰，專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.1.3 連翹 在連翹薄層色譜鑒別中［3］，由于背景干擾較大，為除去干擾，供試品處理步驟中增加了石油醚脫脂，使背景干擾可以消除。又考察了D101型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5cm，柱高10cm）、聚酰胺柱（14～30目，3g，內(nèi)徑1～1.2cm，用水50mL預(yù)洗）兩種色譜柱，試驗(yàn)結(jié)果表明D101型大孔樹脂柱處理的薄層效果優(yōu)于聚酰胺柱，斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.1.4 地榆 在地榆的薄層色譜鑒別中［1］，展開缸預(yù)平衡15min，水飽和的甲苯需放置過夜后使用，薄層效果最佳。

3.2 高效液相色譜條件考察

沒食子酸的含量測(cè)定的色譜條件［4］，考察了不同色譜柱Zorbax SB－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）和Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），結(jié)果表明用Diamonsil C18柱分離度較好。考察了不同流動(dòng)相的比例及酸度對(duì)分離度和峰形的影響：0.1%磷酸-乙腈（75∶25）、0.1%磷酸-乙腈（85∶15）、0.1%磷酸-乙腈（99∶1）、0.05%磷酸-乙腈（85∶15）、0.05%磷酸-乙腈（99∶1），結(jié)果表明 0.05%磷酸-乙腈（99∶1）最理想，不僅使色譜峰峰形好，而且與相鄰雜峰的分離度均大于1.5。設(shè)定恒定柱溫時(shí)，色譜峰的保留時(shí)間幾乎相差不大，若不設(shè)柱溫時(shí)，溫度差異會(huì)影響色譜峰的保留時(shí)間的變化。

3.3 沒食子酸檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取一定濃度的對(duì)照品溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～400nm波長(zhǎng)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在217和272nm處分別有最大吸收，但在272nm處色譜峰峰形更理想，與雜峰分離度更好，故選定272nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典中藥材薄層色譜彩色圖集［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：206，220.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：76-77.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：212.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：117.

TLC Identification and Determination of Gallic Acid in Qingdu Qulao Pill

Yang Rongyan1，3，Wang Qian2，Liu Xiaoqiu1，Hua Huiming1
（1.Shengyang Pharmaceutical University，Shengyang Liaoning110016，China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing Jiangsu210009，China；3.Siping City Institute for Food and Drug Control，Siping Jilin136000，China）

Objective：To establish identification and determination method of Qingdu Qulao Pill.Methods：TLC was employed to identify four crude herbal elements in Qingdu Qulao Pill and the content of gallic acid was determined by HPLC.Results：The spot developed on TLC was fairly clear.The average recovery of gallic acid was 98.7%with RSD 1.2%.Conclusion：The identification methods are reproducible and specific and the determination method is simple and accurate，which can be used for the quality control of Qingdu Qulao Pill.

Qingdu Qulao Pill；TLC；HPLC

*華會(huì)明，E-mail：huimhua＠163.com

2010-04-22）