武漢工業(yè)學院 劉立鶴

○武漢工業(yè)學院農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質飼料

資源教育部工程研究中心 賀國龍

安琪酵母股份有限公司 李兆文

酵母源生物飼料是以酵母為載體，依托現(xiàn)代生物技術，運用微生物發(fā)酵和酶解工藝，而獲得的具有特定功能和營養(yǎng)性的飼料和飼料添加劑產(chǎn)品。本試驗分別采用了凱氏定氮法、Folin-酚法和考馬斯亮藍法對飼用高活性干酵母、酵母細胞壁多糖和復合酵母進行蛋白質含量的測定。

一、材料與方法

1.試驗材料與設備。試驗酵母源生物飼料樣品分別為福邦?飼用高活性干酵母（水產(chǎn)）、福邦?酵母細胞壁多糖（水產(chǎn)）和福邦?復合酵母（水產(chǎn)），為安琪酵母股份有限公司提供。

（1）蛋白質測定所需試劑。凱氏定氮法：硫酸，硫酸銅，無水硫酸鉀，40%氫氧化鈉，2%硼酸，混合指示劑：甲基紅0.1%乙醇溶液，溴鉀酚綠0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，陰涼期保存期3個月以內，0.05mol/L鹽酸標準溶液，催化劑為3份硫酸銅與50份無水硫酸鉀混合。

Folin-酚法：試劑甲：（A）10gNa2CO3，2gNaOH 和 0.25g酒 石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500mL蒸餾水中。（B）0.5g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100mL蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。試劑乙(商用成品）標準蛋白質溶液:精確稱取0.1018g結晶牛血清清蛋白(BSA)，溶于1L0.9%NaCl溶液中，制成濃度為c=101.8μg/mL的標準蛋白。

考馬斯亮藍法：標準蛋白質溶液（同F(xiàn)olin-酚法所用配制）?？捡R斯亮藍G-250染料試劑（南京建成科技有限公司）

（2）試驗所需儀器。分析天平0.0001g感量，消煮爐，酸式滴定管（50mL），凱氏燒瓶（500mL），半微量水蒸氣蒸餾式，錐形瓶，容量瓶（100mL），通風櫥；721型可見光分光光度計；電子計時器；試管、燒杯若干，Agilent1100液相色譜。

2.試驗樣品前處理。以烘干至恒重的酵母源生物飼料為試驗樣品，以消除水分對試驗結果的影響。

3.蛋白含量的分析方法。

（1）標準蛋白溶液的配制。準確稱取標準蛋白m=0.1018g溶于1000mL的蒸餾水中，配制成標準蛋白溶液，濃度為101.8μg/mL。

（2）凱氏定氮法測蛋白質含量。采用GB5511-1985法檢測酵母源生物飼料中蛋白質含量，并參考王潔等蛋白質測定的相關注意事項，以減少蛋白質損失。

（3）Folin-酚法測蛋白質含量。標準曲線繪制：取10支大試管，1支作空白，其余試管分成兩組，分別加入0、0.05、0.10、0.15、0.20、 0.30、0.40、0.50、0.70、0.90mL標準蛋白質溶液（濃度為101.8μg/mL）。用水補足到1.0mL，然后每支試管加入5mL試劑甲，然后迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10min。逐管加入0.5mL試劑乙（Folin-酚試劑），立即混勻后，置于室溫30min，以未加蛋白質溶液的作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。

（4）考馬斯亮藍法測蛋白質含量。標準曲線繪制：取7支試管，1支作空白，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用101.8μg/mL的標準蛋白質溶液給各試管分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，然后用無離子水補充到1.0mL。最后各試管中分別加入5.0mL考馬斯亮藍G-250試劑，加完后立即混合，勿過于劇烈。

利用標準曲線，根據(jù)未知樣品A595值，求出未知樣品蛋白質含量。

（5）氨基酸的檢測方法。試驗樣品的氨基酸分析采用6N鹽酸水解后，按照國標GB/T18246-2000，用外標法，在Aglient1100上分析，送武漢工業(yè)學院分析測試中心進行測定。

4.不同蛋白質檢測方法的初步評價。以3種酵母源生物飼料氨基酸檢測結果作為標準，與3種不同蛋白質檢測方法實際測得的蛋白質值進行比較，初步設定與樣品氨基酸結果接近程度作為評價指數(shù)，評價指數(shù)=100%×被測原料蛋白質含量/被測原料氨基酸含量－100%。

5.統(tǒng)計分析及方法。測定數(shù)據(jù)用Excel軟件中進行初步處理和作圖，再用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果用平均值±標準誤差(X±SD)表示。

二、結果與分析

1.Folin-酚標準曲線的繪制。見圖1。

圖1 Folin-酚法標準曲線及方程

2.考馬斯亮藍標準曲線的繪制。見圖2。

圖2 考馬斯亮藍法標準曲線及方程

3.樣品檢測結果與分析。將干燥好的酵母源生物飼料測定其蛋白質含量。其中，一份用豆?jié){機物理破碎，加入生理鹽水混勻，然后用離心機離心，取上清液稀釋適當倍數(shù)后，采用不同的蛋白質檢測方法測定其蛋白質含量，見表1。

表1 破碎機處理后樣品的蛋白質檢測值（%） （n=4）

另取一份加入生理鹽水，用細胞超聲波細胞破碎儀處理后用離心機離心，取上清液，稀釋適當倍數(shù)后分別用Folin-酚法和考馬斯亮藍法測定其蛋白質含量，見表2。

表2 超聲波細胞破碎儀處理后的樣品的蛋白質檢測值（%） （n=4）

三、討論

1.凱氏定氮法對測定酵母原料蛋白質含量的影響。由表1可知，凱氏定氮法對飼用高活性干酵母、酵母細胞壁多糖和復合酵母中蛋白質含量測定時結果都與高效液相色譜儀所測氨基酸相差很大，分別偏高50.08%、122.16%和55.64%。這主要是因為凱氏定氮法檢測的指標是蛋白質、氨基酸、核酸、尿素和氮為負三價的有機氮化合物，使結果偏高。因此，采用測定總含氮量的方法間接測定酵母源生物飼料中蛋白質含量，檢測的蛋白質含量高于實際蛋白質的含量。

2.Folin-酚法對測定酵母原料蛋白質含量的影響。Folin-酚法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。

在Folin-酚法中，由于加入了Folin-酚試劑強化了雙縮脲反應，使得顯色量增強，檢測靈敏度提高且比較恒定，因而被廣泛應用于不同環(huán)境中的蛋白質混合物或粗提物的測定。然而，其操作復雜、費時，且易受到多種因素影響的缺點。

3.考馬斯亮藍法對測定酵母原料蛋白質含量的影響。由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此，Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，本試驗中飼用高活性干酵母、酵母細胞壁多糖和復合酵母中的精氨酸和苯丙氨酸之和占總氨基酸比例分別為13.45%、18.53%和15.01%，對結果影響較大，但影響多大還不得而知。

四、小結

試驗表明，F(xiàn)olin-酚法檢測蛋白質濃度為0-91.62μg/mL范圍內時與吸光度值有較好的線性關系，相關系數(shù)為0.9956?？捡R斯亮藍法檢測蛋白質濃度為0-101.80μg/mL范圍內時與吸光度值有較好的線性關系，相關系數(shù)為0.9916。二者都能較為準確地測定酵母細胞壁多糖的蛋白含量。