羔羊皺胃酶的兩種鹽析效果比較研究

宋宏新,馬瑛東

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710021)

羔羊皺胃酶的兩種鹽析效果比較研究

宋宏新,馬瑛東

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710021)

采用NaCl和 (NH4)2SO4兩種鹽析劑在 pH4.6、4℃下對羔羊皺胃進行鹽析,鹽析時間為14 h,比較兩種不同的鹽析劑的鹽析效果.分析經(jīng)不同飽和度的鹽溶液鹽析沉淀得到的皺胃酶蛋白含量、活性回收率和純化效果.結(jié)果表明:酶活性回收率較高的為 (NH4)2SO4,其活性回收率為 90%,而純化效果最好的為 NaCl,可使皺胃酶純化 2.13倍.

羔羊皺胃酶;酶活性回收率;純化倍數(shù)

0 引言

近年來隨著干酪產(chǎn)量的增加,對凝乳酶的需求量不斷增大,小牛皺胃酶供應(yīng)短缺,價格上漲,而成年牛胃中皺胃酶的含量又較少,這就迫使科學(xué)家們千方百計地尋找皺胃酶的代用品.羔羊皺胃酶是從 2～4周齡羔羊第四胃中提取的一種凝乳酶,其作用是分解乳中κ-酪蛋白的 Phel05-Met106肽鍵,使酪蛋白膠粒失去穩(wěn)定性,在 Ca2+參與下使乳凝固,形成凝乳[1-2].據(jù)不完全統(tǒng)計,我國每年屠宰的羔羊大約有 400～500萬只[3],利用這些資源提取羔羊凝乳酶,可變廢為寶,增加當?shù)剞r(nóng)牧民的經(jīng)濟收入,同時也不會造成環(huán)境污染,不與其他行業(yè)爭奪原料,因此羔羊皺胃酶可以成為很好的小牛皺胃酶的替代品,同時還可以解決環(huán)境污染問題[4].

在目前的皺胃酶生產(chǎn)過程中,一些廠家為了防止液體凝乳酶在貯存期間微生物污染和活性降低,從而將提取的液體皺胃酶經(jīng)過鹽析沉淀,在低溫下干燥后制成粉劑或片劑.因此研究不同鹽析方法對羔羊皺胃酶鹽析效果的影響可以為羔羊皺胃酶的進一步開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

皺胃:2～4周齡的哺乳羔羊皺胃 (陜西高陵);全脂羊奶粉:陜西閻良;其他化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 羔羊皺胃酶的提取

將 2～4周齡的羔羊屠宰后取出皺胃,清除內(nèi)容物,剝?nèi)ブ竞徒Y(jié)締組織,用手術(shù)刀刮下皺胃黏膜 ,混合均勻 ,與 8%NaCl溶液以 1︰10混合.用超聲細胞破碎儀在 20℃、20～25 kHz、30 W/cm2超聲強度下提取 30 min,然后在 3 000 r/min下離心 15 min,除去雜質(zhì).取上清液,即得羔羊皺胃酶原溶液.再用 1 mol/L HCl調(diào)整 pH至 4.60,室溫下激活 12 h,即可獲得皺胃酶溶液[5].

1.3 凝乳活性的測定

取 10 mL 120 g/L的全脂羊奶粉液在 35℃保溫 10 min,加入 0.1 mL皺胃酶液,迅速混合均勻,準確記錄從加入酶液到乳凝固的時間 (s).把 40 min凝固 1 mL 100 g/L脫脂奶粉的酶量定義為一個索氏單位(Sohxlet unit)[6].

式中:T為凝乳時間,s;D為稀釋倍數(shù).

1.4 酶活性回收率及酶純化倍數(shù)[7]的計算

皺胃酶鹽析沉淀后,在 7 000 r/min下 4℃離心 20 min,沉淀用 8%NaCl溶液溶解,調(diào) pH至4.60,測定皺胃酶活性,然后用下式計算酶活性回收率:

1.5 蛋白質(zhì)的測定

采用考馬斯亮藍法,以蛋白質(zhì)含量為橫坐標,以 595 nm處測定的吸光度值為縱坐標繪制標準曲線.每個樣品重復(fù) 3次.

1.6 兩種鹽析方法[8-9]

(NH4)2SO4鹽析法:將羔羊皺胃酶原溶液pH調(diào)至 4.60,室溫下激活 12 h后,取 6份等體積酶液,分別加入 (NH4)2SO4粉末,使溶液中(NH4)2SO4飽和度為 30%、50%、60%、70%、80%、90%,調(diào) pH至 4.60,4℃下放置 14 h,冷凍離心后,取與上清液等體積的 8%NaCl溶液溶解沉淀,測定沉淀中羔羊皺胃酶的凝乳活性及其蛋白質(zhì)含量.

NaCl鹽析法:根據(jù)王畢妮[10]的研究,在 NaCl鹽析前,激活后的羔羊皺胃酶原液有必要使用A12(SO4)3溶液進行預(yù)處理,因為 A12(SO4)3溶液有利于 NaCl的鹽析,而且可以除去部分雜蛋白.首先考察不同濃度 0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.25 mol/L、0.3 mol/L的A12(SO4)3溶液的處理效果,加入量為酶液體積的 4%,在室溫下靜置,待分層后在 4℃下,7 000 r/min下離心 20 min,取上清液,分別測定各上清液的凝乳活性和蛋白含量,選擇最優(yōu)的A12(SO4)3濃度.A12(SO4)3處理后,分別取 7份等體積已激活酶液,各添加已研碎的 NaCl至25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%飽和度,再校正酶液 pH至等電點 4.60,4℃下靜置 14 h,7 000 r/min冷凍離心后,用與上清液等量的 8%NaCl溶液溶解沉淀,最后測定沉淀中羔羊皺胃酶的凝乳活性及蛋白質(zhì)含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 (NH4)2SO4對羔羊皺胃酶鹽析效果的研究

不同硫酸銨飽和度對酶液鹽析效果的影響見表1,硫酸銨鹽析效果 SDS-PAGE圖如圖 1所示.

由表1可以看出,隨著 (NH4)2SO4飽和度的增加,沉淀中羔羊皺胃酶的活性回收率也逐漸增加,當其飽和度達到一定程度時,活性酶幾乎完全沉淀析出;超過此飽和度后,活性回收率就不再提高.(NH4)2SO4飽和度在 30%～60%之間時,酶活性回收率僅為 20%～50%;當 (NH4)2SO4飽和度在 60%～80%時,隨著 (NH4)2SO4飽和度的增大,酶活性回收率明顯提高,在 (NH4)2SO4飽和度為 80%時,酶活性回收率達到最高為 90%,其純化倍數(shù)也提高了 1.23倍.當隨著飽和度的再次提高,凝乳活性反而降低,可能過高的鹽析濃度會導(dǎo)致部分酶的失活.由圖 1看出隨著 (NH4)2SO4濃度的升高,析出的活性物質(zhì)增多,但其對皺胃酶的純化效果并不明顯,因為 (NH4)2SO4濃度的升高會一直伴隨著其他的雜蛋白析出,因此最高只能將其純化 1.23倍.

表1 不同飽和度的硫酸銨對酶液鹽析效果的影響

圖1 硫酸銨鹽析效果 SDS-PAGE圖

2.2 Al2(SO4)3和 NaCl對羔羊皺胃酶鹽析效果的研究

2.2.1A12(SO4)3濃度的選擇

A12(SO4)3的添加量對羔羊皺胃酶液的影響見表2,硫酸鋁處理效果 SDS-PAGE圖如圖 2所示.

由表2可以看出,隨著 A12(SO4)3濃度的增加,上清液中的蛋白含量在不斷地減少,說明沉淀中的蛋白含量在增加,與試驗現(xiàn)象相符合.而在A12(SO4)3的濃度達到 0.15 mol/L的時候,隨著添加量的增加,酶上清液中的蛋白基本不再明顯減少,說明A12(SO4)3添加量的增大不會對其除雜效果產(chǎn)生影響,通過圖 2觀察其處理的效果.隨著A12(SO4)3的濃度的增加,其酶液的活性回收率,比活以及純化倍數(shù)都逐漸減少,說明A12(S O4)3除去部分雜蛋白的同時也損失了部分酶活性.因此選擇活性回收率以及比活相對較高的 0.1 mol/L A12(SO4)3來處理酶原液.

表2 A12(SO4)3添加量對羔羊皺胃酶液的影響

圖2 硫酸鋁鹽析效果 SDS-PAGE圖

2.2.2 NaCl對羔羊皺胃酶鹽析效果

不同飽和度NaCl對酶液鹽析效果的影響見表3,NaCl鹽析效果 SDS-PAGE圖如圖 3所示.

試驗中當 NaCl飽和度在 25%～60%時,未發(fā)現(xiàn)有沉淀析出,當飽和度在 60%以上時才有沉淀析出.從表3可以看出,在其飽和度為 65%～85%時,隨著 NaCl濃度的升高,其活性回收率在不斷升高,直到 75%的時候達到最大值 35.32%,之后隨著濃度的升高,活性回收率降低,酶比活及其純化倍數(shù)也有所下降,這是因為隨著 NaCl濃度的增大會有部分雜蛋白析出,所以最適的 NaCl飽和度為 75%,在 NaCl飽和度為 75%時羔羊皺胃酶蛋白純化高達 2.13倍,從電泳圖 3也可以看出其純化效果,基本上沒有雜蛋白出現(xiàn),但是其酶活性回收率相對較低,最高也只有 35.32%.試驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)過鹽析后的上清液依然具有較高的酶活性(總酶活的 20%),說明除了硫酸鋁處理過程中造成酶活損失外,由于經(jīng)過處理的酶上清液中蛋白含量降低,導(dǎo)致其鹽析沉淀不完全也是 NaCl鹽析法的酶活性回收率低的主要原因.

表3 不同飽和度的 NaCl對酶液鹽析效果的影響

圖3 NaCl鹽析效果 SDS-PAGE圖

3 結(jié)論

硫酸銨是目前生產(chǎn)中運用最廣泛的鹽析劑,由于硫酸銨有非常高的溶解度,其溶液中含有大量的離子電荷和較大的離子濃度,其和NH4+具有很強的水化力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出.本研究中當硫酸銨的飽和度為 80%時,鹽析溫度為 4℃,鹽析時間 14 h時,活性回收率可高達 90.7%,但是其對皺胃酶的純化效果相對不理想,只有 1.23倍.硫酸銨沉淀的蛋白中含有大量的所以用此法在生產(chǎn)皺胃酶時需要將除去,這樣會使皺胃酶生產(chǎn)工藝復(fù)雜化,且在去除的過程中可能會對酶活性造成損失,因而不利于酶的生產(chǎn)制備.

食鹽飽和度是影響蛋白溶解度的重要因素,通常鹽濃度越高,越有利于蛋白凝聚沉淀下來,從NaCl對羔羊皺胃酶鹽析結(jié)果來看,在鹽析溫度為4℃,鹽析時間 14 h的條件下,當 NaCl在飽和度為 75%時其活性回收率相對很低只有 35.32%.這可能是因為經(jīng)過硫酸鋁處理過后的皺胃酶液中的蛋白含量太少,導(dǎo)致不利于蛋白析出,據(jù)報道[11]:在 NaCl存在的較低 pH下,皺胃酶很容易發(fā)生自溶,所以其活性回收率很低.但是從純化程度來看,其對皺胃酶的純化倍數(shù)可高達2.13倍,而且其中的雜蛋白極少,說明 NaCl鹽析皺胃酶具有很好的純化作用,并且在皺胃酶液中是允許有NaCl大量存留的,因此不需要像硫酸銨鹽析法那樣除鹽,如果進一步對 NaCl鹽析皺胃酶進行研究,就可以簡化羔羊皺胃酶的生產(chǎn)工藝.

羔羊皺胃酶作為奶酪,尤其是高檔羊奶酪生產(chǎn)使用的重要凝乳酶有重要的開發(fā)前景,生產(chǎn)中對酶制劑中的有限量要求,但合適的 NaCl則為奶酪工藝所需,從兩種鹽析方法的比較來看,硫酸銨鹽析法可以獲高達 90%的酶活性回收率,但是其純化效果不及 NaCl鹽析法,要去除硫酸銨鹽析物中的會使生產(chǎn)工藝復(fù)雜化;NaCl鹽析法鹽析皺胃酶的純化效果相對比較好 (可高達2.13倍),無需脫鹽操作,因此若能采取措施避免此過程中酶活性的失活,再采用超濾等濃縮技術(shù)將處理后的上清液進行適當?shù)臐饪s,可以進一步提高 NaCl鹽析效率.

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COMPAR ISON OF SALTI NG-OUT EFFECTS OF LAMB RENNET I N T WO SALTI NG-OUT AGENTS

SONG Hong-xin,MA Ying-dong
(College of Life Science and Engineering,Shanxi University of Science and Technology,Xi’an710021,China)

In this paper,we studied and compared the salting-out effects of lamb rennet in t wo salting-out agents,i.e.NaCl and(NH4)2SO4,under the conditions of pH 4.6,temperature 4℃,and salting-out ti me 14 hours.We also analyzed the protein content,the activity recovery and the purification effect of the rennet obtained by salting out in salt solutionswith different saturations.The results showed that the rennet had higher activity recovery of 90%in the(NH4)2SO4salting-out agent;and the rennet had higher purification factor of 2.13 in the NaCl salting-out agent.

lamb rennet;recovery of rennet activity;purification factor

TS201.2

B

1673-2383(2010)05-0038-04

2010-07-26

宋宏新 (1959-),男,陜西興平人,教授,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)、食品生物安全性及分子免疫檢測方面的研究.