山竹多酚的分離制備及清除自由基活性研究

熊何健,吳國宏,王莉芳,喬小瑞

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建廈門 361021)

山竹多酚的分離制備及清除自由基活性研究

熊何健,吳國宏,王莉芳,喬小瑞

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建廈門 361021)

通過響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化山竹外果皮中多酚類物質(zhì)的提取工藝,并對其清除自由基活性進(jìn)行了研究.多酚浸提的最佳工藝參數(shù)為:乙醇溶液體積分?jǐn)?shù) 60%、液料比18︰1、浸提時(shí)間 66 min,在此條件下,多酚浸出率為 11.38%.提取液經(jīng) XDA—7大孔樹脂柱層析純化,得山竹多酚,樣品多酚含量為 87.19%,其清除 DPPH、羥基自由、超氧陰離子自由基 IC50值分別為:4.67 mg/L、41.4 mg/L和 27.0 mg/L.

山竹;多酚;制備;自由基

0 引言

山竹 (Garcinia m angostanaL)又名山竹子、莽吉柿、鳳果,為藤黃科藤黃屬的一種種間雜交的異源多倍體果樹,原產(chǎn)于馬來群島,是一種典型的熱帶水果[1],主要分布于泰國、越南、馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓等東南亞國家,我國臺(tái)灣、福建、廣東和云南也有引種[2].山竹果實(shí)可食部分占29%～45%,含有蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素及豐富的礦物質(zhì)元素,其中檸檬酸含量 0.63%、維生素 C為 12 mg/kg、可溶性固形物 16.8%,有機(jī)酸0.63%[1].山竹外果皮呈黑紫紅色,切片曬干后可作藥用,一直作為泰國傳統(tǒng)醫(yī)藥,用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、化膿、慢性潰瘍、白帶、淋病等疾病的治療[3].

山竹前期研究多集中在山竹的栽培[4-5]、營養(yǎng)成分、無機(jī)元素、風(fēng)味成分的分析[3,6]及山竹果殼中紅色素的利用等方面[7,8].近年來的研究表明,占單果鮮重 52%～68%的山竹外果皮中,含有氧雜蒽酮、單寧酸和原花青素等一系列多酚類化合物,具有抗氧化、抑制腫瘤等諸多生理活性[9-11],有較高的開發(fā)利用價(jià)值.作者以山竹外果皮為原料,多酚為目標(biāo)組分,通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法等建立山竹外果皮中多酚類物質(zhì)的分離制備工藝,并對其清除自由基活性進(jìn)行檢測,為山竹多酚的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

山竹:購于廈門集美,收集外果皮,干燥,0℃以下儲(chǔ)藏備用.

沒食子酸、DPPH、福林-酚試劑:sigma公司;羥自由基、超氧陰離子自由基檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所;XDA—7大孔樹脂:西安藍(lán)曉科技有限公司;其他試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

山竹外果皮→粉碎→溶劑浸提→浸提液真空濃縮→濃縮液→樹脂吸附→有機(jī)溶液洗脫→洗脫液真空濃縮→冷凍干燥→山竹多酚.

1.2.2 提取條件的選擇

干燥山竹外果皮粉碎,過 40目篩.各取 2.00 g山竹皮粉末,乙醇溶液超聲波浸提,超聲頻率 40 kHz,超聲功率 100 W收集浸提液,測定浸提液中多酚含量,計(jì)算多酚浸出率,比較不同浸提條件對多酚浸出效果的影響.

1.2.3 大孔吸附樹脂純化

山竹外果皮粉末經(jīng)溶劑浸提后,浸提液真空濃縮回收溶劑,濃縮液上 XDA—7大孔樹脂柱(200 mm ×28 mm)吸附,吸附速率 2 BV/h,吸附完成后用 2 BV蒸餾水洗脫,然后用 60%乙醇溶液常溫洗脫,洗脫速率 4 BV/h,收集洗脫液,真空濃縮,冷凍干燥.

1.2.4 多酚含量的測定[12]

福林 -酚試劑分光光度法,樣品中多酚含量以沒食子酸計(jì).以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得回歸方程為:Y=0.009 4X+0.003 7(R2=0.999 7).

1.2.5 樣品清除自由基活性測定

清除 DPPH活性:分光光度法[13].

清除O2-·、·OH自由基活性:按照檢測試劑盒檢測方法測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提液體積分?jǐn)?shù)對多酚浸出率的影響

分別用 0、20%、40%、60%、80%乙醇溶液作為浸提液超聲浸提山竹外果皮,分析浸提液體積分?jǐn)?shù)對多酚浸出率的影響,結(jié)果見圖 1.

圖1 浸提液體積分?jǐn)?shù)對多酚浸出率的影響

由圖 1可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加多酚提取率不斷提高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 60%左右時(shí)提取率達(dá)到最大值,浸提液體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步提高,多酚提取率反而降低,這與山竹外果皮中多酚類物質(zhì)的構(gòu)成與極性有關(guān).

2.2 浸提時(shí)間對多酚浸出率的影響

分別采用不同浸提時(shí)間 (30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)對原料進(jìn)行超聲波浸提處理,分析浸提時(shí)間對山竹殼多酚提取率的影響,結(jié)果見圖 2.

圖2 浸提時(shí)間對山竹殼多酚浸出率的影響

由圖 2可知,60 min時(shí)多酚類物質(zhì)基本達(dá)到浸出平衡,繼續(xù)延長時(shí)間,多酚浸出率增加緩慢,同時(shí),浸提時(shí)間過長,山竹殼中的雜質(zhì)成分溶解也隨之增加,將會(huì)影響多酚的純化.

2.3 液料比對多酚浸出率的影響

分別采用液料比 9︰1、12︰1、15︰1、18︰1、21︰1、24︰1對原料進(jìn)行超聲波浸提處理,分析浸提液料比對山竹殼多酚提取率的影響,結(jié)果見圖 3.

圖3 液料比對多酚浸出率的影響

由圖 3可知,液料比達(dá)到 18︰1時(shí),原料中的多酚物質(zhì)已基本溶出,繼續(xù)增加溶劑的用量,浸出率趨于穩(wěn)定,生產(chǎn)中過大的料液比也會(huì)造成后續(xù)濃縮時(shí)能耗增加和溶劑的浪費(fèi).

2.4 浸提條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法(Response Surface Analysis,簡稱 RSA),并根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理,設(shè)計(jì) 3因素 3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),對浸提條件進(jìn)行優(yōu)化.

2.4.1 分析因素的選取以及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以液料比 X1(15︰1、18︰1、21︰1)、浸提時(shí)間X2(45 min、60 min、75 min)和浸提液體積分?jǐn)?shù) X3(50%、60%、70%)3個(gè)因素為自變量,以多酚浸出率 Y為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見表1.

2.4.2 試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒑妥顑?yōu)化分析

利用 Design Expert 7.0軟件對表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得響應(yīng)值多酚浸出率 Y對自變量液料比 X1、浸提時(shí)間 X2和浸提液體積分?jǐn)?shù) X3的二次多項(xiàng)回歸模型方程為:

Y= -19.67+1.9933X1+0.25533X2+0.15950X3-5.6111E-003X1X2+3.9167E-003 X1X3+5.5E-004X2X3-0.0507X21-1.4056E-003X22-2.31250E-003X23.

回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)判定,P值越小,則相應(yīng)變量的顯著程度越高,回歸分析結(jié)果列于表2.

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

表2 回歸模型方差分析表

由表2可知,3個(gè)試驗(yàn)因子中對響應(yīng)值影響的主次順序?yàn)?X2＞X1＞X3,即浸提時(shí)間 ＞液料比 ＞浸提液濃度,對響應(yīng)值的影響達(dá)到極顯著水平,X3、X1X2、X23對響應(yīng)值的影響也達(dá)到顯著水平,表明試驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系,二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對響應(yīng)值都有很大關(guān)系.

模型 P=0.003 5,表明該二次多項(xiàng)回歸模型高度顯著.失擬檢驗(yàn) P=0.115 9＞0.05,不顯著,無失擬因素存在,模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù),R2=0.966 4,說明預(yù)測值和實(shí)測值之間具有高度的相關(guān)性,因此可用此模型對試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測.

響應(yīng)指標(biāo)對應(yīng)于因素 X1、X2、X3水平構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖,可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響,從因素交互作用的等高線及響應(yīng)面圖(圖 4、圖 5、圖 6)可以分析出它們之間的相互作用.由圖 4～圖 6可知,在所選范圍內(nèi)存在極值.運(yùn)用 SAS軟件確定模型因素的最佳水平,理論最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù) 57.76%,液料比18.26︰1,浸提時(shí)間 65.69 min,模型預(yù)測的最大浸出率11.52%.考慮實(shí)際操作的局限性,將理論值修正為乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%,液料比 18︰1,浸提時(shí)間66 min,在此條件下進(jìn)行浸提試驗(yàn),多酚浸出率為 11.38% ±0.05%(n=3),與理論值的誤差為1.48%,表明模型能較好地預(yù)測實(shí)際浸出率.

利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳浸提條件浸提山竹外果皮原料,浸提液濃縮,經(jīng) XDA-7大孔吸附樹脂純化,洗脫液濃縮、凍干,得山竹多酚,多酚含量為87.19%.

圖4 液料比和浸提時(shí)間對多酚浸出率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖(X3=60%)

2.5 山竹多酚清除自由基活性

1,1-二苯基 -2-三硝基苯肼 (DPPH)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的脂質(zhì)自由基,DPPH清除活性通常作為天然抗氧化劑初期篩選的檢測指標(biāo)[14-15].超氧陰離子自由基 (·)、羥自由基(·OH)是生物體內(nèi)兩種重要的氧自由基,·是多種自由基中間體的母體,·OH的氧化活性極強(qiáng),能與活細(xì)胞中任何生物大分子發(fā)生反應(yīng),引起脂質(zhì)過氧化、DNA損失和多糖的降解等,對機(jī)體危害極大,對·和·OH的清除能力是抗氧化物質(zhì)活性檢測的重要指標(biāo)[16-18].

配制一定濃度經(jīng)柱層析純化的山竹果皮多酚樣品的水溶液,檢測其清除 DPPH、羥自由基和超氧陰離子自由基活性,結(jié)果見圖 7、圖 8和圖 9.

圖7 山竹多酚清除 DPPH自由基活性

山竹多酚表現(xiàn)出良好的自由基清除活性,且隨質(zhì)量濃度的增加清除作用增強(qiáng),存在明顯的量效關(guān)系.根據(jù)自由基清除曲線的趨勢線方程,計(jì)算山竹多酚清除自由基 IC50值,結(jié)果見表3.

表3 山竹多酚清除自由基 IC50值

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法對山竹外果皮中多酚類物質(zhì)浸提的關(guān)鍵因子進(jìn)行了優(yōu)化,建立了浸出率與液料比、浸提時(shí)間和浸提液體積分?jǐn)?shù)的二次多項(xiàng)式回歸方程,對 3因素及其交互作用進(jìn)行了分析,得出多酚浸提的優(yōu)化條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù) 60%、液料比18︰1、浸提時(shí)間 66 min,在此條件下進(jìn)行浸提試驗(yàn),多酚浸出率為 11.38%.

多酚浸提液經(jīng)大孔吸附樹脂純化處理后,冷凍干燥得山竹多酚產(chǎn)品,多酚含量為 87.19%.產(chǎn)品具有較強(qiáng)的清除自由基活性,對 DPPH、羥基自由、超氧陰離子自由基清除活性 IC50值分別為4.67 mg/L、41.4 mg/L和 27.0 mg/L.

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PREPARATI ON OF POLYPHENOLS FROMGARCIN IA MANGOSTANA PER ICARP AND FREE RAD ICAL SCAVENGI NG ACTI V ITY

XI ONG He-jian,WU Guo-hong,WANG Li-fang,Q I AO Xiao-rui
(B ioengineering College,Jim ei University,X iam en361021,China)

The article adopted the response surface methodology(RS M)to optimize the preparation process of polyphenols fromGarcinia m angostanapericarp,and studied the free radical scavenging activity of polyphenols.The results showed that the optimal extraction conditions of polyphenols were as follows:ethanol 60%(V/V),liquid to material ratio 18︰1,and extraction time 66 minutes.Under the optimal conditions,the extraction rate of polyphenolswas 11.38%.The extractwas purified by XDA-7 macroporous resin column to obtain theGarcinia m angostanapolyphenolswith the content of 87.19%.The IC50values of the polyphenols in scavenging free radicals,such asDPPH,hydroxyl free radical,and superoxide anion free radicalwere 4.67 mg/L,41.4 mg/L and 27.0 mg/L respectively.

Garcinia m angostana;polyphenols;preparation;free radical

TS201.1

B

1673-2383(2010)05-0025-05

2010-06-01

集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目(2006A002)

熊何健 (1968-),男,江西東鄉(xiāng)人,副研究員,研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng).