石油微生物16S rRNA基因PCR擴(kuò)增研究

卞立紅，曲麗娜，汪 洋,張 虹，黃永紅

(1.大慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 大慶 163712；2. 大慶師范學(xué)院 科研處，黑龍江 大慶 163712)

0 引言

16S rRNA為原核生物核糖體中一種核糖體RNA，大小約1.5Kb左右。其種類少，含量大(約占細(xì)菌RNA含量的80%)，分子大小適中，存在于所有的生物中，特別是其進(jìn)化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱[1-4]。

近年來，16SrRNA基因技術(shù)在石油微生物生態(tài)的研究中起到越來越重要的作用，該技術(shù)的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和純種分離技術(shù)的限制。填補(bǔ)了細(xì)胞生物學(xué)研究油藏微生物的生態(tài)的不足[5]。隨著分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法的發(fā)展，人們運(yùn)用基于16S rRNA(rDNA)基因的分子生物學(xué)方法來分析復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，所有研究結(jié)果表明原油儲層存在很高的微生物多樣性，這些結(jié)果使人們進(jìn)一步了解了原油儲層微生物生態(tài)系統(tǒng)[6]。用基于16S rRNA(rDNA)基因的分子生物學(xué)方法來分析復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，通過熒光原位雜交(FISH)、克隆建庫、對原油儲坑地層水中微生物群落進(jìn)行研究，并通過競爭PCR對其中優(yōu)勢菌群進(jìn)行定量分析[7]。進(jìn)一步了解原油儲層微生物生態(tài)系統(tǒng)。目前16S rDNA的PCR擴(kuò)增片段通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)的方法常被用來分析微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，通過對DGGE優(yōu)勢條帶序列的研究來分析各群落中的優(yōu)勢成員[8]。對油田微生物提高原油采收率的現(xiàn)場應(yīng)用提供很多有價值的信息。石油微生物16S rRNA基因保守區(qū)的擴(kuò)增是先進(jìn)分子水平鑒定微生物種類的一種有效實(shí)驗(yàn)方法。16S rRNA既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)來較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家及分類學(xué)家所接受[1]。所以，細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究特設(shè)委員會建議依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分類。細(xì)菌的16S rRNA可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物將16S rRNA片斷擴(kuò)增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。并可通過對其序列的分析，判定不同菌屬、菌種間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近[9]。對不同細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較分析是推斷細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化關(guān)系的一個重要方法。通過上述的方法，我們進(jìn)行對石油微生物16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增研究。

本實(shí)驗(yàn)以大慶油田分離純化的某一種或幾種石油微生物為實(shí)驗(yàn)材料，摸索合適的石油微生物基因組DNA的提取方法及合適的PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系，為后續(xù)本實(shí)驗(yàn)室開展石油微生物方面的分子水平實(shí)踐指導(dǎo)有著重要的意義。

1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料

將采集的大慶采油三廠排出井水樣迅速進(jìn)行真空抽濾，抽濾過程中于無菌布氏漏斗上分10次隨機(jī)抽取1毫升水樣接種到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并于37℃恒溫箱中靜止進(jìn)行富集培養(yǎng)，OD600達(dá)0.4～0.6時，進(jìn)行DNA提取。

1.2 試劑與儀器

1.2.1試劑

1)主要試劑有20mg/ml蛋白酶K、110mg/ml溶菌酶、1mol/l Tris、50mmol/l EDTA、5.0mol/l NaCl、酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)、異丙醇、700μl SET溶液、瓊脂糖25g、1500bp DNA Marker、25μl SDS。

2)提取緩沖液：CTAB/NaCl(10%CTAB，0.7mol/l NaCl)，在80ml H2O中溶解4.1g NaCl，緩慢加入CTAB(十六烷基三乙酸溴化銨)，同時加熱并攪拌，定容終體積至100ml。

3)引物序列如下：上游引物序列為：5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物序列為：5‘-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。

4)TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2.2儀器

高速離心機(jī)：TDL-40B(上海安亭儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)：UVP凝膠成像系統(tǒng)(Upland. U.S.A)；超低溫冰箱：NR-C26WF11(松下)；自動滅菌裝置：YXQ-LS-SⅡ(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電熱恒溫水槽：HHS(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；制冰機(jī)：AF100-AS；電子天平：BS124.3(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；保溫箱(電熱恒溫培養(yǎng)箱)：HPP-9162(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；多通道PCR儀：PTC-240(上海安亭儀器廠)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生物基因組DNA的提取方法

第一種方法為溶酶法，提取方法如下：

1) 細(xì)胞收集：0D600=0.4收集菌液1.5ml，置于12000 rpm離心5min；形成菌體細(xì)胞沉淀物。

2) 裂解細(xì)胞：棄上清，向離心所得菌體沉淀加入裂解緩沖液(1mol/l Tris、50mmol/l EDTA、1.0mol/l NaCl)，并加入700μlSET溶液，25μlSDS溶液，15μl蛋白酶K，180μl溶解酶，輕微混勻，直到細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，置于37℃保溫1h。

3)基因組DNA抽提：加入100μl5.0mol/lNaCl充分混勻，再加入80μlCTAB/NaCl溶液混勻，于65 ℃溫育10min。

4)再加等體積的氯仿、異戊醇(24∶1)，置于12000 rpm離心5min。

5)吸上清，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，離心。

6)取上清液加0.6體積的異丙醇，醇沉30min，離心，自然風(fēng)干后溶于50μl的TE，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第二種提取方法為試劑盒法，步驟如下：

使用前請先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標(biāo)簽。

1) 取細(xì)菌培養(yǎng)液1-5ml，10，000rpm(-11，500×g)離心1分鐘，盡量吸凈上清。

2) 向菌體沉淀中加入200μl緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸浮。

3) 向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混勻。

4) 加入220μl緩沖液GB，振蕩15秒，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清涼，簡短離心以除管蓋內(nèi)壁的水珠。

5) 加220μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

6) 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱防如收集管中)，12，000rpm(～13，400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7) 向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8) 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm(～13，400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

9) 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm(～13，400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

10) 將吸附柱CB3放入收集管中，12，000rpm(～13，400×g)離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中的殘余漂洗液。

11) 將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5分鐘，12，000rpm(～13，400×g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系

1)R擴(kuò)增的反應(yīng)體系。25μl反應(yīng)總體積，包括2μlPCR反應(yīng)緩沖液，0.5μl10mmol/l dNTP混合液，10pmole引物各1μl，50ng基因組DNA，2.5U TaqDNA聚合酶，其余用去離子水補(bǔ)足。

2)CR條件的探索。首先設(shè)定PCR的溫度，在50℃～60℃選擇8個梯度，這8個梯度分別是50.6、51.8、53.0、54.2、55.4、56.6、57.8、59。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳的檢測，可判斷最適條件為53.0℃。

3)PCR擴(kuò)增的條件。95℃預(yù)變性10min，95℃變性50s，53℃退火50s，72℃延伸1min，循環(huán)30次。

4)瓊脂糖凝膠電泳的檢測。制備1%瓊脂糖膠：稱取0.3克瓊脂糖，加入30毫升1×TAE，微波加熱溶解，待冷卻后，倒入制膠槽制成1%瓊脂糖膠。吸5μlPCR產(chǎn)物，1μl10×Loading buffer進(jìn)行混合，點(diǎn)樣。在120V的電壓下，電泳20min，紫外燈下掃描。將瓊脂糖凝膠放在YLNO2000凝膠影像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 基因組DNA的檢測結(jié)果

經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳的檢測，圖片上采用試劑盒法所顯示的DNA條帶成彌散狀，而圖片上采用溶菌酶法所顯示的DNA條帶亮度大，濃度、質(zhì)量高，因此，采用溶菌酶法進(jìn)行DNA提取要好于試劑盒法。

圖1 基因組DNA瓊脂糖檢測結(jié)果

2.1.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

16S rRNA基因PCR擴(kuò)增出兩條帶的片段的分別是800bp和1400bp左右。

圖2 石油微生物16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 討論

微生物具有變異快的特點(diǎn)，微生物的變異除了受到微生物本身的生理特性影響外，外界的環(huán)境因子對其變異的影響也是不容忽視的。傳統(tǒng)的微生物研究方法只能從微生物的形態(tài)學(xué)角度加以研究，而對于微生物受環(huán)境因子影響所造成的在分子水平上變異信息的捕捉能力是十分有限的。這就制約了微生物生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，就能將微生物在基因?qū)用嫔纤l(fā)生的變異與環(huán)境因子相結(jié)合，對維持微生物生態(tài)系統(tǒng)平衡的動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行深入研究。

從油藏水樣中抽提的DNA的質(zhì)量是16SrRNA基因技術(shù)在油藏微生物生態(tài)研究中的應(yīng)用成功的一個關(guān)鍵步驟，提取效率的低下或樣品中其他物質(zhì)的干擾，都會使實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差[10]。由于16SrRNA 序列的保守性和存在的普遍性以及核酸序列本身的穩(wěn)定性，序列分析的重現(xiàn)性極高，基于當(dāng)今分析技術(shù)的改進(jìn)，應(yīng)用16SrRNA 作為分子指標(biāo)，可以實(shí)現(xiàn)快速、微量、準(zhǔn)確簡便的對微生物進(jìn)行分類鑒定。

本文通過對石油微生物DNA的提取采用兩種不同的方法，利用16SrRNA基因PCR擴(kuò)增研究了石油微生物的大致類別。石油微生物DNA的提取采用了兩種不同的實(shí)驗(yàn)方法：溶菌酶法和試劑盒法。通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，溶菌酶法提取石油微生物的DNA條帶亮度大、濃度、質(zhì)量高，而試劑盒法提取的DNA條帶成彌散狀，可能由于試劑盒法所要通過的濾膜次數(shù)多，故而DNA損失的量也多，造成了DNA條帶呈彌散狀。溶菌酶法較適合革蘭氏陽性菌，而不適合提取革蘭陰性菌的基因組DNA。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的16S rRNA 基因兩條片段大小分別是800bp和1400bp左右，符合該引物擴(kuò)增的古菌和細(xì)菌的片段大小，是這兩類菌的混合物。而古菌與細(xì)菌在進(jìn)化樹上相聚較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，主要表現(xiàn)在結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度以及各自某些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。相對細(xì)菌而言，古菌結(jié)構(gòu)比較簡單。古菌細(xì)胞壁有一種特殊成分叫塔羅糖醛酸。古菌沒有肽聚糖，古菌的細(xì)胞膜存在獨(dú)特的單分子層或單、雙分子混合膜，其中含有醚鍵。而細(xì)菌細(xì)胞壁主要組份是肽聚糖，是一層較厚(5～80nm)、質(zhì)量均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)包括莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞[11-13]。

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)中，溶菌酶法提取石油微生物優(yōu)于試劑盒法，所提取的DNA濃度、質(zhì)量高。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增以53℃，退火50 S為最適條件。初步斷定，該地層石油微生物為古菌和細(xì)菌的混合菌。

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