生物膜胞外聚合物的檢測技術與功能的研究進展

黃敏婷,陸 春

(中山大學附屬第三醫(yī)院,廣東廣州 510630)

生物膜胞外聚合物的檢測技術與功能的研究進展

黃敏婷,陸 春＊

(中山大學附屬第三醫(yī)院,廣東廣州 510630)

生物膜胞外聚合物是黏附在生物膜周圍,保證生物膜功能及完整性的生物合成聚合物。近幾年,生物膜胞外聚合物的物理化學性質、生物功能及其檢查技術備受關注。就生物膜胞外聚合物的組成、檢測技術及功能幾方面展開綜述。

生物膜胞外聚合物;組成;研究方法與技術;功能

生物膜胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)是一種在生物膜中,使細胞與其他特殊物質凝聚、結合在一起的有機生物合成聚合物,主要黏附在微生物生物膜周圍,保證生物膜功能及完整性的物質。EPS的產生是自然環(huán)境中生物膜的普遍特性,在原核與真核生物中均可發(fā)現(xiàn)[1]。本文就EPS近期的研究內容展開綜述。

1 EPS的組成成分與其影響因素

EPS是三維的、膠樣的、高度水合的混合物,主要由多種有機高分子物質組成,如多糖、蛋白、核酸、磷脂、褐藻酸、腐殖質以及其他多聚混合物,其中也不乏一些低分子無機物,如硫酸鹽等,它們在某種程度上可極大地改變生物膜的結構與物理化學性質。EPS中的糖類主要包含:單糖、糖醛酸、氨基糖等;磷脂類包含:脂肪酸、甘油、磷酸酶、氨基乙醇、絲氨酸、膽堿等;腐殖質類包含酚類混合物等,不同種類的微生物群體,EPS成分有所不同[1]。Tsuneda[2]對27種異養(yǎng)需氧菌EPS的組成進行研究,發(fā)現(xiàn)多糖和蛋白質為EPS主要成分,占整個EPS質量的75%～89%,且多糖中的己糖、己糖胺、酮糖占有相當高的比重。從油井分離出來的一種嗜熱細菌MS-1[3],其EPS也含有48.3%～54.5%多糖,多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例為2.04∶1.00∶0.89;而蛋白類占EPS的37.2%～42.4%,包括蛋氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、組胺酸和絲氨酸。而Jabbouri[4]認為EPS的性質與成分的多樣性取決于微生物種類和培養(yǎng)條件,其研究發(fā)現(xiàn)多聚N-乙酰葡糖胺(PNAG)是表皮葡萄球菌EPS的主要成分,除PNAG和蛋白外,胞外磷壁質也是表皮葡萄球菌生物膜中一種新的組分。D′Abzac[5]從4種厭氧顆粒污泥的EPS中提取到了9種物質,主要為腐殖酸類物質、蛋白和多糖,其中小部分重要的無機物可占EPS干燥重量的22%～70%?？梢?微生物種類決定了EPS的主要成分,但對多數的EPS而言,多糖與蛋白類物質仍然占了相當大的比例,因此,可根據不同微生物群體的EPS成分不同,有目的選擇不同的標記物對EPS進行研究。

EPS的成分來源于不同的途徑,如細胞活動分泌、細胞表面分泌、細胞溶解以及從外界環(huán)境吸收等,故影響以上途徑的因素均可影響EPS的組成。Mitik-Dineva[6]研究了5種海洋細菌在2種玻璃表面的增殖情況,結果顯示5種細菌在化學蝕刻、光滑的納米玻璃表面黏附能力均增強,EPS分泌水平也相應增高,說明在不同材料上所形成的生物膜其EPS的組成也不相同。Jang[7]在比較硝化和去硝化2種情況下生物膜的變化時,發(fā)現(xiàn)去硝化作用可減少EPS的濃度(主要是可溶性的蛋白及高分子量碳水化合物濃度)和降低生物膜的疏水性,從而導致沉淀絮狀物老化,影響生物膜的生物特性,說明不同的生物膜培養(yǎng)條件對EPS的組成也可造成重要影響。所以,在研究不同處理方式下對EPS的影響時,需考慮培養(yǎng)條件及環(huán)境等因素的影響。

2 EPS的研究方法與技術

EPS的檢測技術主要有破壞性及非破壞性分析2種[1]。破壞性分析主要指通過各種方法提取出EPS主要成分,再運用各種技術對提取物進行分析研究,如D′Abzac[8]研究發(fā)現(xiàn)EPS提取物中的無機物成分及含量,極大地依賴于不同的提取方法和厭氧污泥的不同種類,使用離心法、超聲波降解法、加熱提取法均可獲得相似的無機物構成比,而陽離子樹脂交換法可使EPS提取物中的鈉離子含量增加,化學提取法則容易使提取物被雜質或萃取劑污染。Ni[9]利用凝膠滲透色譜法(GPC)、熒光三維激發(fā)/發(fā)射矩陣光譜技術(EEM)和數學建模,對活性污泥中微生物所產生的EPS性質進行研究,結果可觀察到EPS提取物的色彩層析譜中存在7個波峰,其中3個為多糖類物質,4個為蛋白類物質。Simon[10]提出利用尺寸排阻色譜法(SEC)及2個串連的色譜柱,對厭氧污泥顆粒中提取出來的EPS進行分析,可獲得更詳細的層析譜。而Park[11]的研究則說明了宏蛋白質組學(Metaproteomic)分析法是深入研究活性污泥EPS中蛋白質的有效方法,Metaproteomic分析法的原理主要是應用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對蛋白質進行分離純化,后再通過液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/ MS)對蛋白質進行鑒定和分析。這些技術雖然都有利于EPS主要成份的深入研究,但對EPS造成了不可逆的破壞而不利于動態(tài)觀察。

在非破壞性分析方面,有電子顯微鏡、掃描探針技術、磁共振光譜法、共聚焦激光掃描顯微鏡等技術[1]。如Adav[12]提出選用7種不同的熒光染料,即標記核酸的SYTOX藍、標記脂質的尼羅紅、標記β-多糖的卡爾科弗盧爾白、標記α-聚糖的伴刀豆球蛋白A、標記蛋白的異硫氰酸熒光素、標記活細胞的SYTO63、用于監(jiān)測鈣水平的鈣綠,對EPS的不同成分進行原位雜交標記后,采用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLS M)和MATLAB軟件,可對EPS進行定位、定量分析。有研究[3]說明透射電子顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡也可用于高溫情況下(如油田)觀察微生物膜的輪廓以及EPS的形態(tài)結構。而Quilès[13]使用衰減全反射—傅里葉變換紅外光譜技術(ATR-FTI R),觀察到浮游細菌的代謝情況和生物膜形成的初始階段,還發(fā)現(xiàn)蛋白、核酸和多糖的ATR-FTIR光譜數據變化與浮游細菌的生長、生理狀態(tài)的改變相關聯(lián),提示這一過程可能伴隨EPS主要成份的產生。Ivleva[14]則提出一種無需標記的極有潛質的非破壞性檢測EPS的技術——拉曼顯微鏡技術(RM),利用RM可研究不同種類生物膜的化學性質,包括微生物的組分和EPS,主要原理為RM可與各種不同結構的生物膜相互作用,分析其化學成分及提供化學相關信息,其結果與CLS M分析結果有著較好的一致性,將兩者聯(lián)合更有利于生物膜成分復雜結構的深入研究。上述檢測技術均有利于直觀認識EPS的形態(tài)和結構,并能在各種處理下對EPS進行較好的動態(tài)追蹤及觀察,但是,在未知生物膜EPS主要成分的情況下,所選用的標記物能否特異性的結合目標物質,以及能否得到較全面的標記物對EPS各種成分進行標記等問題,尚待進一步解決。

3 EPS的功能與意義

EPS主要負責生物膜結構與功能的完整性,是決定生物膜物理化學與生物學性質的關鍵。EPS形成的膠樣網狀系統(tǒng),有利于維持生物膜菌體相互凝聚在一起,調節(jié)生物膜表面的黏附,參與感染的建立,以及保護細菌免受環(huán)境中有害物質的侵擾。關于EPS還可能存在的功能,概括如表1[1]。

表1 EPS可能存在的功能Table 1 Selection of proposed effects due to microbial EPS

因EPS具有吸附能力(解毒作用),使得EPS常用于環(huán)境治理、污水凈化等方面,如Kong[15]對4種不同的活性污泥的EPS(包括可溶解的和固定的)吸收染料酸性湖藍A的能力進行研究,結果顯示干燥厭氧污泥顆粒的吸收能力最強,且不同種類的污泥中可溶解和固定的EPS吸收能力也不相同,提示選用合適的菌種和反應模型可提高EPS的去污凈化能力。而Tourney[16]在研究EPS的物理化學性質對鋅離子吸附的影響時,卻發(fā)現(xiàn)移除EPS對金屬離子吸附能力的影響并不大,且EPS產生的溶解性有機碳(DOC)可降低生物膜對金屬離子的吸收,提示工業(yè)應用中生物膜反應器里過量的EPS可能降低金屬離子的清除效率。在醫(yī)學方面,致病微生物生物膜的形成是慢性感染、耐藥性產生等問題的重要原因之一,對致病微生物生物膜EPS功能的研究和利用,往往有助于消除生物膜或阻止生物膜形成。如I wai[17]研究發(fā)現(xiàn)極端嗜熱菌生物膜EPS的主要成分飽和硅酸,可以促進細胞之間及細胞與培養(yǎng)皿間的相互作用,從而形成生物膜結構;并包繞生物膜細胞表面發(fā)揮維持生物膜完整性的功能。在保持生物膜完整性的基礎上,EPS還可改變自身的組成與生物特性以協(xié)助生物膜系統(tǒng)適應環(huán)境的變化,如粘液性銅綠假單胞菌[18]在生物膜形成時可產生一些胞外酶,如EstA、LasB、LipC,可影響生物膜的形成與空間分布以適應環(huán)境的變化。同時,EPS有利于細菌抵抗宿主免疫的功能:Wagner[19]發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細胞(P MN)趨于黏附生長階段的銅綠假單胞菌生物膜,成熟的生物膜因不分泌3OC12-HSL而對PMN無趨化作用,其一系列的實驗證實了成熟與生長階段的生物膜主要區(qū)別在于EPS中海藻酸鹽的有無,但生物膜深層細胞逃避宿主免疫攻擊主要原因還是成熟生物膜的EPS限制了PMN的穿透,說明EPS有保護生物膜內部細菌、抵抗宿主免疫的屏障功能。還有研究[20]將可以表達生物膜降解酶的噬菌體轉染至生物膜中的大腸埃希菌細胞內,重組噬菌體在細胞內大量復制并表達溶解酶DspB,最終致細菌溶解及EPS降解,生物膜被清除,體現(xiàn)了EPS在形成及維持生物膜狀態(tài)中起著必不可少的作用。

4 結 語

由于生物膜廣泛存在于日常生活、生產環(huán)境中,對生物膜胞外聚合物進行深入研究、了解生物膜的物理化學性質及生物特性,有助于人們將其靈活應用于工業(yè)生產、食品制造、污水處理、醫(yī)學行業(yè)等各種領域,尤其是胞外聚合物在致病微生物生物膜中所起作用的深入研究,對醫(yī)學上的臨床治療問題有著重要的指導意義。

[1]Wingender J,Neu T R,Flemming H.Microbial extracellular polymeric substance:characterization,structure,and function [M].Berlin:Springer-Verlag KG,1999:1-42.

[2]Tsuneda S,Aikawa H,Hayashi H,et al.Extracellular polymeric substances responsible for bacterial adhesion onto solid surface [J].FEMS Microbiol Lett,2003,223(2):287-292.

[3]Liu J,Wang J,Bai X,et al.Isolation of a thermophilic bacterium and analysis of its extracellular polymeric substance[J]. Wei Sheng Wu Xue Bao,2008,48(2):152-156.

[4]Jabbouri S,Sadovskaya I.Characteristics of the biofilm matrix and its role as a possible target for the detection and eradication of Staphylococcus epidermidis associated with medical implant infections[J].FEMS I mmunol Med Microbiol,2010.

[5]D’Abzac P,Bordas F,Van Hullebusch E,et al.Extraction of extracellular polymeric substances(EPS)from anaerobic granular sludges:comparison of chemical and physical extraction protocols[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,85(5):1589-1599.

[6]Mitik-Dineva N,Wang J,Truong V K,et al.Differences in colonisation of five marine bacteria on two types of glass surfaces [J].Biofouling,2009,25(7):621-631.

[7]JangN,Ren X,Choi K,et al.Comparison of membrane biofouling in nitrification and denitrification for the membrane bioreactor(MBR)[J].Water Sci Technol,2006,53(6):43-49.

[8]D’Abzac P,Bordas F,Joussein E,et al.Characterization of the mineral fraction associated to extracellular polymeric substances (EPS)in anaerobic granular sludges[J].Environ Sci Technol, 2010,44(1):412-418.

[9]NiB J,Fang F,Xie W M,et al.Characterization of extracellular polymeric substances produced by mixed microorganisms in activated sludge with gel-permeating chromatography,excitation-emission matrix fluorescence spectroscopy measurement and kinetic modeling[J].Water Res,2009,43(5):1350-1358.

[10]Simon S,Pairo B,Villain M,et al.Evaluation of size exclusion chromatography(SEC)for the characterization of extracellular polymeric substances(EPS)in anaerobic granular sludges[J]. Bioresour Technol,2009,100(24):6258-6268.

[11]Park C,Helm R F.Application of metaproteomic analysis for studying extracellular polymeric substances(EPS)in activated sludge flocs and their fate in sludge digestion[J].Water Sci Technol,2008,57(12):2009-2015.

[12]Adav S S,Lin J C,Yang Z,et al.Stereological assessment of extracellular polymeric substances,exo-enzymes,and specific bacterial strains in bioaggregates using fluorescence experiments [J].Biotechnol Adv,2010,28(2):255-280.

[13]Quiles F,Humbert F,Delille A.Analysis of changes in attenuated total reflection FTIR fingerprints of Pseudomonas fluorescens from planktonic state to nascent biofilm state[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc,2010,75(2):610-616.

[14]Ivleva N P,Wagner M,Horn H,et al.Towards a nondestructive chemical characterization of biofilm matrix by Raman microscopy[J].Anal Bioanal Chem,2009,393(1):197-206.

[15]Kong W S,Liu Y.[Adsorption of a dye by sludges and the roles of extracellular polymeric substances][J].Huan Jing Ke Xue, 2007,28(12):2716-2721.

[16]Tourney J,Ngwenya B T,FredM J,et al.Physical and chemical effects of extracellular polymers(EPS)on Zn adsorption to Bacillus licheniformis S-86[J].J Colloid Interface Sci,2009,337 (2):381-389.

[17]I wai S,Doi K,Fujino Y,et al.Silica deposition and phenotypic changes to Ther mus thermophilus cultivated in the presence of supersaturated silicia[J].IS ME J,2010,4(6):809-816.

[18]Tielen P,Rosenau F,Wilhelm S,et al.Extracellular enzymes affect biofilm formation of mucoid Pseudomonas aeruginosa[J]. Microbiology,2010.

[19]Wagner M,Ivleva N P,Haisch C,et al.Combined use of confocal laser scanningmicroscopy(CLS M)and Raman microscopy (RM):investigations on EPS-Matrix[J].Water Res,2009,43 (1):63-76.

[20]Lu T K,Collins J J.Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104 (27):11197-11202.

Detection and Function of Bio-Membrane Extracellular Polymer

HUANG Min-Ting,LU Chun
(The Third Affil.Hosp.of Sun Yat-sen Uni.,Guangzhou510630)

Bio-membrane extracellular polymer(BMEP)is a bio-synthesis polymer that sticks and attaches to the bio-membrane to assure the function and integrity of bio-membrane.Recently physicochemical and biological properties of BMEP and its detection technique were deeply paid close attention to.The components of BMEP,its detection technique,functions and other aspects were summarized in this article.

bio-membrane extracellular polymer(BMEP);component;detection method;function

Q73;Q93-33

A

1005-7021(2010)06-0082-04

黃敏婷 女,碩士研究生。研究方向為皮膚病與性病。Tel:020-85253017,E-mail:huangminting1985@yahoo.com.cn

＊通訊作者。E-mail:pifuke@126.com

2010-10-24;

2010-11-19