產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株CE-1的篩選與鑒定

張?jiān)鱿? 王 偉 郝建華 牛 瑞 孫 謐

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所海洋產(chǎn)物資源與酶工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306）

產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株CE-1的篩選與鑒定

張?jiān)鱿?,2, 王 偉1, 郝建華1, 牛 瑞1, 孫 謐1

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所海洋產(chǎn)物資源與酶工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306）

經(jīng)過(guò)含 H2O2的平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩, 從保存的水樣中篩選到一株過(guò)氧化氫酶高產(chǎn)菌株CE-1,其所產(chǎn)過(guò)氧化氫酶活性和比活分別為1 356.2 U/mL和3 401 U/mg。菌株CE-1為革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌,根據(jù)其形態(tài)特征、16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析和生理生化特性, 以及屬內(nèi)不同種間性狀差異等因素的綜合分析, 將菌株CE-1鑒定為氣單胞屬（Aeromonas）細(xì)菌。

過(guò)氧化氫酶;分離;鑒定;系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

過(guò)氧化氫酶（hydroperoxidase, catalase, 過(guò)氧化氫氧化還原酶, EC1.11.1.6）是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶, 能夠高效催化過(guò)氧化氫分解, 具有清除生物體內(nèi)自由基, 保護(hù)細(xì)胞免受損害等作用[1]。由于其高效催化的能力, 近年來(lái)廣泛用于食品、醫(yī)學(xué)診斷以及紡織、造紙等工業(yè)領(lǐng)域[2]。近幾十年來(lái)過(guò)氧化氫酶一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3], 而目前國(guó)內(nèi)對(duì)微生物過(guò)氧化氫酶的研究主要集中在其發(fā)酵生產(chǎn)、酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用方面[2,4～11]。本實(shí)驗(yàn)是在對(duì)實(shí)驗(yàn)室所保存的水樣進(jìn)行廣泛篩選的基礎(chǔ)上, 篩選分離出一株高過(guò)氧化氫酶活性的菌株并對(duì)其進(jìn)行了分類(lèi)鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析, 為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

基礎(chǔ)培養(yǎng)基: 蛋白胨 1%, 牛肉膏 0.3%, NaCl 0.5%, pH 7.0～7.5。

1.2 主要試劑和儀器

考馬斯亮藍(lán)G250, USB公司; ExTaq DNA聚合酶,大連寶生物工程有限公司; 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Nikon 50i型顯微鏡: 日本 Nikon公司; Sonics VCF1500超聲破碎儀: 美國(guó) Sonics公司; 日立高速冷凍離心機(jī): 日本HITACHI公司; 752N紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì): 上海精密科學(xué)儀器有限公司; PCR儀:德國(guó)Whatman Biometra公司。

1.3 水樣

所用水樣為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海洋產(chǎn)物資源與酶工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株的篩選和分離

1.4.1 初篩

含 2%（w/v）瓊脂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃加入H2O2, 使終濃度達(dá)1 mmol/L。倒平板。以200 μL樣品涂布, 25 ℃培養(yǎng)24 h。生長(zhǎng)出的單菌落劃斜面保藏。

1.4.2 復(fù)篩

初篩獲得的菌株從斜面接入含50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL搖瓶。200 r/min, 25 ℃條件下培養(yǎng)24 h。離心收菌體, 以pH 7, 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液重懸菌體并在冰浴中超聲破碎。離心后取上清測(cè)過(guò)氧化氫酶活性和蛋白含量。

1.5 酶活力和蛋白含量的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶酶活力采用紫外分光光度法[12]。測(cè)無(wú)菌體的發(fā)酵液和破碎后上清的活性。酶活性以H2O2在 240 nm處分解速率進(jìn)行計(jì)算。反應(yīng)體系為50 mmol/L pH 7磷酸鹽的鈉鹽緩沖液, H2O2濃度20 mmol/L。取一定量樣品加到1 mL磷酸鹽緩沖液中,在比色杯中混勻, 再迅速加入以磷酸鹽緩沖液配制的40 mmol/L的H2O21 mL起始反應(yīng)。以時(shí)間（x）對(duì)吸光度（y）作圖, 直線(xiàn)回歸計(jì)算出斜率即反應(yīng)速率。將25 ℃每分鐘消耗 1μmol H2O2的酶量定義為一個(gè)活力單位。

蛋白含量測(cè)定采用Bradford法[13]。過(guò)氧化氫酶比活力計(jì)算公式:

1.6 形態(tài)特征的觀(guān)察

將經(jīng)過(guò)篩選所確定的菌株, 平板劃線(xiàn), 25 ℃培養(yǎng)24 h, 觀(guān)察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色[14]。

1.7 16S rDNA的PCR擴(kuò)增和測(cè)序以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

提取細(xì)菌總 DNA, 以 16S rDNA通用引物:27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’）和 1492r（5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’）擴(kuò)增, PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[15]。

PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。將所測(cè)定菌株的16S rDNA序列通過(guò)BLAST檢索已有序列, 進(jìn)行相似性比較分析, 下載與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近的序列, 用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì), 采用MEGA4軟件的鄰接法（neighbor-joining method）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.8 產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株的生理生化鑒定

根據(jù)菌株培養(yǎng)特征,細(xì)胞形態(tài),革蘭氏染色和氧化酶反應(yīng)選擇法國(guó)梅里埃公司API 20E試劑條,測(cè)定菌株生理生化反應(yīng),并參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩結(jié)果

用含高濃度過(guò)氧化氫的平板進(jìn)行初篩, 25 ℃培養(yǎng)24 h后初篩平板上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落, 說(shuō)明在水樣中存在過(guò)氧化氫酶活性較高的菌株。將生長(zhǎng)出的菌落分別劃線(xiàn)分離, 共篩選到 14株高活性菌株,斜面培養(yǎng)基4 ℃保藏。

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果

上述14株菌株經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后, 測(cè)定酶活性和蛋白質(zhì)含量。結(jié)果顯示, 比活力大于1 200 U/mg的菌株僅有7株。這7株菌分別經(jīng)8次搖瓶傳代培養(yǎng)后, 僅有1株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性較好, 酶活力和比活分別達(dá)到1 356.2 U/mL和3 401 U/mg, 是第一代菌株酶活性的90.2%, 而其他菌株均低于80%。故確定該菌為下一步的實(shí)驗(yàn)菌株, 并命名為CE-1。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征

菌株 CE-1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上25 ℃培養(yǎng)24 h,菌落為乳白色、微凸、易挑取, 表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊。菌體大小約為 0.2～0.5 μm×1.0～4.4 μm; 革蘭氏染色陰性; 呈桿狀, 圓端, 單個(gè)或短鏈狀排列。

2.2.2 菌株CE-1的16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株CE-1的16S rDNA PCR產(chǎn)物測(cè)序, 獲得長(zhǎng)度為1384 bp的序列（登錄號(hào)GQ161962）。與 GenBank已有序列進(jìn)行比較, 菌株 CE-1的 16S rDNA與豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）的序列（登錄號(hào)X74674）完全一致。用MEGA4軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）, 可見(jiàn)CE-1是氣單胞屬細(xì)菌。

2.2.3 生理生化特征

將菌株CE-1和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān)的氣單胞菌屬菌株的特性進(jìn)行比較, 可見(jiàn)存在明顯差別（表1）。

16S rDNA序列分析一般應(yīng)用于區(qū)分和確定屬之間的關(guān)系, 通常不能以此作為定種的依據(jù), 而且在相似度達(dá)到 97%以及以上時(shí)會(huì)大大降低鑒定的可靠性[16,17]。而在氣單胞菌屬中各菌種的16S rDNA相似度都很高, 根據(jù)16S rDNA相似性無(wú)法確認(rèn)CE-1是豚鼠氣單胞菌。菌株CE-1的生理生化性狀同16S rDNA相似菌株（包括豚鼠氣單胞菌）的性狀的比較中,產(chǎn)半乳糖苷酶、產(chǎn)精氨酸雙水解酶、產(chǎn)明膠酶、使山梨醇氧化/發(fā)酵、產(chǎn)細(xì)胞色素氧化酶、使葡萄糖氧化和使苦杏仁苷氧化/發(fā)酵等指標(biāo)中存在很大的差異,這些生化指標(biāo)的差別會(huì)影響將CE-1鑒定到種的準(zhǔn)確性, 因此將其鑒定為氣單胞菌屬細(xì)菌。

3 結(jié)論

采用添加 H2O2的平板培養(yǎng)基, 從實(shí)驗(yàn)室所保存的水樣中篩選到具有高效產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶能力的菌株CE-1, 并用API 20E試劑條和16S rDNA序列進(jìn)行綜合分析, 將這株細(xì)菌鑒定為氣單胞屬細(xì)菌。菌株CE-1產(chǎn)酶穩(wěn)定性良好, 經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵測(cè)得酶活力和相對(duì)酶活分別達(dá)到1 356.2 U/mL和3 401 U/mg, 這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株相比有一定的優(yōu)勢(shì)（表 2）。本實(shí)驗(yàn)再次證明 H2O2平板法篩選高活性過(guò)氧化氫酶菌株是方便有效的[12]。而且在目前產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株的大量研究中, 尚未見(jiàn)氣單胞菌屬細(xì)菌高產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的報(bào)道, 該菌株的成功分離提供了新的產(chǎn)過(guò)氧化氫酶微生物資源, 同時(shí)也豐富了對(duì)氣單胞菌的認(rèn)識(shí)。

圖1 菌株CE-1的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位Fig. 1 Phylogenetic Status of strain CE-1

表1 菌株CE-1和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān)的氣單胞菌屬菌株的生理生化特征比較Tab. 1 Comparison of physiological characteristics of strain CE-1 with related Aeromonas species

表2 一些菌株產(chǎn)過(guò)氧化氫酶水平比較Tab. 2 Comparison of catalase production by different strains quantitated by activity in medium

目前從Aspergillus niger分離純化得到的過(guò)氧化氫酶已經(jīng)進(jìn)行了工業(yè)生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用, 其所產(chǎn)過(guò)氧化氫酶酶活力為 4000 U/mg[23], 本實(shí)驗(yàn)所篩選得到的菌株CE-1所產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的比活可達(dá)3 401 U/mg,對(duì)比可見(jiàn)CE-1具有較大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力, 是一株值得深入研究的菌株。下步的工作將對(duì)該菌株誘變育種以及最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化, 同時(shí), 本實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展為后續(xù)酶的分離純化以及性質(zhì)研究等提供了必要的基礎(chǔ), 也對(duì)下一步的研究具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] Schriner S E, Linford N J, Martin G M, et al. Extension of murine life span by overexpression of catalase targeted to mitochondria[J]. Science, 2005, 308（5 730）:1 909-1 911.

[2] 曹翔宇, 華兆哲, 燕國(guó)梁, 等. 過(guò)氧化氫酶發(fā)酵生產(chǎn)條件優(yōu)化及在染整清潔生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J]. 工業(yè)微生物, 2006, 36（4）: 7-12.

[3] 劉冰, 梁嬋娟. 生物過(guò)氧化氫酶研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2005, 21（5）: 223-232.

[4] 段緒果, 沈微, 李艷麗, 等. 耐熱過(guò)氧化氫酶基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2006, 25（2）: 74-78.

[5] 陸挺, 汪成富, 戴英, 等. 過(guò)氧化氫酶發(fā)酵性能的研究[J]. 蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)）, 2001, 17（3）: 95-97.

[6] 王凡強(qiáng), 王正祥, 邵蔚藍(lán), 等. 熱穩(wěn)定性過(guò)氧化氫酶工程菌株發(fā)酵條件的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002,28（2）: 11-14.

[7] 劉建忠, 劉杰, 翁麗萍, 等. 巰基乙酸對(duì)過(guò)氧化氫酶的激活及其機(jī)制研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2001, 40（6）: 39-41.

[8] 王凡強(qiáng), 王正祥, 邵蔚藍(lán), 等. 重組大腸桿菌熱穩(wěn)定性過(guò)氧化氫酶的純化及性質(zhì)研究[J]. 微生物學(xué)報(bào),2002, 42（3）: 348-353.

[9] 劉昌齡, 王國(guó)慶. 細(xì)菌過(guò)氧化氫酶的分離、結(jié)晶及性質(zhì)[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 1990, 17（5）:380-383.

[10] 冷曬祥, 錢(qián)國(guó)坻, 華兆哲, 等. 過(guò)氧化氫酶的棉針織物漂染工藝研究[J]. 印染, 2006, 32（19）: 1-3.

[11] 花慧, 黃松, 沈國(guó)強(qiáng), 等. 不同防腐劑對(duì)過(guò)氧化氫酶防腐效果的研究[J]. 食品添加劑, 2005, 26（1）:167-169.

[12] WANG Wei, SUN Mi, LIU Wan-shun. Isolation and characterisation of H2O2-decomposing bacteria from Antarctic seawater[J]. Annals of Microbiology, 2008,58（1）: 29-33.

[13] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72 （1-2）: 248-254.

[14] 東秀珠, 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2001. 353-388.

[15] Rousseaux S, Hartmann A, Soulas G. Isolation and characterisation of new Gram-negative and Grampositive atrazine degrading bacteria from different French soils[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2001,36 （2-3）: 211-222.

[16] George M. Garrity, Don J. Brenner, et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition[M].New York: Springer, 2005: 556-571.

[17] Stackebrandt E, Goebel B M.Taxonomic note: a place for DNA-DNA Reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1994, 44（4）: 846-849.

[18] 唐丹玲, 唐文勝. 產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的乳酸菌的篩選和產(chǎn)酶條件的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1992, 6: 30-33.

[19] 周一, 嚴(yán)自正, 盧運(yùn)玉, 等. 耐熱過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生菌的篩選和發(fā)酵條件的研究[J]. 微生物學(xué)報(bào), 1990,30（3）: 223-227.

[20] 趙志軍, 華兆哲, 劉登如, 等. 堿性過(guò)氧化氫酶高產(chǎn)菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2007, 34（4）: 667-671.

[21] Petruccioli M, Fenice M, Piccioni P, et al. Effect of stirrer speed and buffering agents on the production of glucose oxidase and catalase by Penicillium variabile（P16） in benchtop bioreactor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1995, 17（4）: 336-339.

[22] Fiedurek J, Gromada A. Production of catalase and glucose oxidase by Aspergillus niger using unconventional oxygenation of culture[J]. Journal of Applied Microbiology, 2000, 89（1）: 85-89.

[23] Yumoto I, Yamazaki K, Kawasaki K, et al. Isolation of Vibrio sp. S-l exhibiting extraordinarily high catalase activity[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998, 85（1）: 113-116.

Received: Dec., 10, 2009

Key words:Catalase; Isolation; Identification; Phylogenetic analysis

Abstract:Catalase-producing strain CE-1 was isolated from water samples using H2O2-containing plate screening and activity assay of the shake flask culture method. The values of the activity and specific activity were 1356.2 U/mL and 3401U/mg, respectively. CE-1 was Gram negative and rod in shape. Based on the comprehensive analysis of morphological and physiological characteristics, the 16S rDNA phylogenetic tree, and the differences among different species of Aeromonas, strain CE-1 was identified to be Aeromonas.

（本文編輯:康亦兼）

Isolation and identification of catalase-producing strain CE-1

ZHANG Zeng-xiang1,2, WANG Wei1, HAO Jian-hua1, NIU Rui1, SUN Mi1
（1. Laboratory of Marine Products and Enzyme Engineering, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China）

Q554+.6

A

1000-3096（2010）11-0054-05

2009-12-10;

2010-04-20

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA091602）; 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41006119）; 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所

基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（2010-gy-01）

張?jiān)鱿椋?984-）, 男, 山東安丘人, 碩士研究生, 主要從事微生物過(guò)氧化氫酶研究, 電話(huà): 0532-85833961; E-mail: zhangzengxiang@yeah.net;孫謐, 通信作者, 電話(huà): 0532-85819525, E-mail: sunmi@ysfri.ac.cn