喙尾琵琶甲抗菌活性的研究

施貴榮，莊孝龍，孫會(huì)仙，陳 艾

（大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000）

喙尾琵琶甲抗菌活性的研究

施貴榮，莊孝龍，孫會(huì)仙，陳 艾

（大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000）

目的：觀察喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的體外抑菌活性。方法：采用試管稀釋法測(cè)定喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)5株臨床分離的MRSA菌株的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），初步判斷其抑菌效果。結(jié)果：喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)5株MRSA的MIC值為0.98~1.95mg/mL，MBC值為3.9~7.8mg/mL。結(jié)論：喙尾琵琶甲乙醇提取物具有良好的體外抑菌活性。

喙尾琵琶甲；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；抗菌作用；最小抑菌濃度

近年來由于抗生素濫用導(dǎo)致大量藥物相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生藥源性疾病，同時(shí)還導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性和耐藥菌感染流行的嚴(yán)重后果，使臨床治療更為困難。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是引起化膿性疾病的重要病原菌，目前已經(jīng)成為一些大型綜合醫(yī)院最常見的醫(yī)院感染菌之一，并且表現(xiàn)為異質(zhì)和多重耐藥性〔1〕，給臨床治療帶來極大的困難。

喙尾琵琶甲（Blaps rynchopetera Fairmaire）屬鞘翅目擬步甲科琵琶甲屬，是云南少數(shù)民族地區(qū)長(zhǎng)期使用的一種藥用昆蟲，具有抗菌、消炎、解毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用，主要用于治療發(fā)熱、咳嗽、胃炎、疔瘡、腫瘤等病癥〔2〕。李蕾、羅氘蕓、劉勇等〔3-5〕對(duì)喙尾琵琶甲進(jìn)行了抗菌活性成分研究，但尚未見對(duì)臨床分離耐藥菌株的研究報(bào)道。本課題組就喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)臨床分離的MRSA進(jìn)行初步的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，為耐藥菌株的治療以及喙尾琵琶甲的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材 樣品采自大理州鳳儀鎮(zhèn)，由大理學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院毛本勇教授鑒定為喙尾琵琶甲。

1.2 供試菌株 5株臨床分離的MRSA來自大理州醫(yī)院住院病人和門診病人。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色特點(diǎn)和膠乳凝集試驗(yàn)，經(jīng)VITEK-32全自動(dòng)微生物分析儀GPI鑒定卡（法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)）作菌株鑒定。

質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物教研室提供。

1.3 培養(yǎng)基 MH瓊脂（杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：090817），MH肉湯（杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：090526）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），F(xiàn)D-1C-80冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步祺）。

1.5 方法

1.5.1 樣品的制備 取喙尾琵琶甲粗粉，加乙醇冷浸提取4次，每次24 h。合并乙醇提取液，濃縮得乙醇提取浸膏。浸膏樣品用水溶解，經(jīng)冷凍干燥得凍干粉，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 供試菌株的活化 將所有供試菌株分別接種于MH瓊脂平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h活化，待用。

1.5.3 菌液制備 挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度，使其相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用MH液體培養(yǎng)基稀釋后備用。稀釋后的菌液在15min內(nèi)接種。

1.5.4 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 取無(wú)菌小試管15支作為一組，共6組。其中，第13、14、15管分別為“原液對(duì)照管”、“肉湯對(duì)照管”、“測(cè)試菌生長(zhǎng)對(duì)照管”。每支試管分別加入MH肉湯2m L。配制喙尾琵琶甲乙醇提取物原液濃度為250mg/mL，用吸管吸取藥液2 m L放入第1管內(nèi)，混勻后吸取2 m L放入第2管，依此法逐管進(jìn)行稀釋至第12管。除第13、14管外，每支試管加入菌液0.1 mL，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。在對(duì)照管符合要求的情況下，凡無(wú)肉眼可見的細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為藥物對(duì)該測(cè)試菌的MIC〔6-7〕。

1.5.5 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定 分別從各肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的試管中取0.02 mL于相應(yīng)培養(yǎng)基的瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。平板上計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落作為該藥物對(duì)該測(cè)試菌的MBC〔8〕。

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果

喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)各供試菌的作用結(jié)果見表1和表2。

表1 喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)MRSA的MIC（mg/mL）

表2 喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)MRSA的MBC（mg/mL）

由表1和表2結(jié)果顯示，喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)5株MRSA和ATCC25923的MIC值分別為0.98~1.95 mg/mL、0.98 mg/mL；MBC值分別為3.9~7.8 mg/mL、3.9mg/mL。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)收集的菌株進(jìn)行鑒定，采用液體稀釋法，參照NCCLS/CLIS2006標(biāo)準(zhǔn)判斷，苯唑西林的MIC值大于或等于4μg/mL可定義為MRSA菌株，本實(shí)驗(yàn)中5株臨床分離株的苯唑西林MIC均大于4μg/mL，而用PBP2膠乳凝集試劑盒檢測(cè)5株菌所產(chǎn)的PBP2蛋白〔9〕，結(jié)果均呈陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)了5株菌株均為MRSA。

抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)5株MRSA及標(biāo)準(zhǔn)株均有顯著的抑菌作用，并且對(duì)同一種菌的不同菌株表現(xiàn)出相近的抑菌活性。這一結(jié)果提示可能喙尾琵琶甲提取物的抗菌作用機(jī)制與目前臨床常用的治療MRSA感染的藥物作用機(jī)制有所區(qū)別，尚有待后續(xù)研究。本次實(shí)驗(yàn)只涉及喙尾琵琶甲粗提物的體外抗菌活性，至于其在體內(nèi)是否能達(dá)到有效的抗菌濃度治療感染，還需通過建立動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索其抑菌活性，為其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)

〔1〕張堅(jiān)磊.細(xì)菌耐藥性的新問題〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2001，22（1）：45.

〔2〕張?zhí)m勝，夏從龍，楊永壽，等.彝藥喙尾琵琶甲的研究進(jìn)展〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（12）：3113-3114.

〔3〕李蕾，羅氘蕓，劉勇.云南琵琶甲抗菌活性成分研究〔J〕.中草藥，2001，32（3）：197-199.

〔4〕羅氘蕓，劉勇，李蕾.云南琵琶甲脂溶性抗菌活性成分研究〔J〕.中草藥，1999，30（8）：566-567.

〔5〕劉勇，羅氘蕓，李蕾，等.云南琵琶甲防御性分泌物抗菌活性及GC-MS分析〔J〕.云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，22（3）：217-219.

〔6〕陳奇，卞如濂，陳修.中藥藥理研究方法學(xué)〔M〕.2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：274-277.

〔7〕徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.3版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1649-1661.

〔8〕黃燕，肖艷芬，甄漢深，等.苦玄參體外抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.廣西中醫(yī)藥，2008，31（1）：46-47.

〔9〕吳偉元，王凌偉，盧月梅，等.三種檢測(cè)甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌方法的比較〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（2）：306-307.

（責(zé)任編輯 蔣 康）

Study into the Antibacterial Activity ofBlaps rynchopetera Fairmaire

SHIGuirong，ZHUANG Xiaolong,SUN Huixian,CHENG Ai
（College of Pharmacy,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To observe the in vitro antibacterial activity of ethanol-extract ofBlapsrynchopeteraFairmaire against methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA）.Methods:The minimum inhibition concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC）of ethanol-extract ofBlapsrynchopeteraFairmaire against 5 strains MRSA isolated from clinical sampleswere carried outby tube dilutionmethod.Results:The MIC and the MBC of ethanol-extractofBlapsrynchopeteraFairmaire against 5 strains MRSA were 0.98-1.95 mg/mL and 3.9-7.8 mg/mL,respectively.Conclusion:The Ethanol-extract ofBlaps rynchopeteraFairmaire has a strong antibacterial activity in vitro.

BlapsrynchopeteraFairmaire;MRSA;antibacterial activity；MIC

Q969.498.2

A

1672-2345（2010）12-0018-02

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（DXSKYX 2010007）

2010-10-21

施貴榮，實(shí)驗(yàn)師，主要從事天然藥物化學(xué)研究.