明目地黃丸中熊果酸含量測定方法比較

肖培云，楊永壽，許嘉強(qiáng)

（大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000）

明目地黃丸中熊果酸含量測定方法比較

肖培云，楊永壽，許嘉強(qiáng)

（大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000）

目的：研究改進(jìn)明目地黃丸中熊果酸的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法和薄層掃描法進(jìn)行含量測定比較。結(jié)果：高效液相色譜法，熊果酸分離完全，回歸方程為Y=509 575X-14.851，r=0.999 7，在0.998～9.980μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為92.6%，RSD為1.6%。薄層掃描法，回歸方程為Y=77 594X-289.2，r=0.998 2，熊果酸在0.998～4.990μg之間呈良好線性關(guān)系，加樣回收率為86.6%，RSD為5.6%。結(jié)論：高效液相色譜法比薄層掃描色譜法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，可更好地控制明目地黃丸的質(zhì)量。

明目地黃丸；高效液相色譜法；薄層掃描色譜法；熊果酸

明目地黃丸是傳統(tǒng)的中成藥方劑，是治療眼病的常用中成藥，收載于《中國藥典》2010年版第一部中，由熟地黃、酒萸肉，牡丹皮、山藥等12味藥組成〔1〕，其功能為滋腎、養(yǎng)肝、明目，用于肝腎陰虛、目澀畏光、視物模糊、迎風(fēng)流淚，并有治療寒冷性過敏〔2-3〕，干眼癥，視疲勞等作用〔4〕。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，明目地黃丸配合中醫(yī)針灸穴位注射治療視網(wǎng)膜色素變性有較好療效〔5〕。

酒萸肉為明目地黃丸配方中的主藥，《中國藥典》2005年版第一部“含量測定”項(xiàng)下采用薄層掃描法測定其主要化學(xué)成分熊果酸的含量〔2〕，2010年版中改用高效液相色譜法（HPLC）測定馬錢苷的含量，以此來控制明目地黃丸中酒萸肉的質(zhì)量〔6〕。而熊果酸為酒萸肉藥材的特征性化學(xué)成分，對控制明目地黃丸的質(zhì)量有重要意義〔7〕。本實(shí)驗(yàn)采用薄層掃描色譜法（TLCS）和HPLC對明目地黃丸中熊果酸的含量進(jìn)行測定，通過這兩種方法的比較，以找到一種操作簡便、準(zhǔn)確的方法，為明目地黃丸的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀包括G1314B可變波長檢測器，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1313A柱溫箱，G1321A熒光檢測器，Agilent 1200色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司），Agilent XBP-C18（4.6mm×250 mm，5μm）色譜柱；CS-930薄層色譜掃描儀（日本島津制作所）；UV2500紫外分光光度計(jì)（日本島津制作所）；AE240電子天平（瑞士梅特勒）；超純水器（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）；SK8200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑 明目地黃丸（云南龍發(fā)制藥有限公司、騰沖東方紅制藥有限公司、騰沖制藥廠）、熊果酸（中國生物制品藥品檢定所，批號：110742-200517），硅膠G板（青島海洋化工廠），甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 溶液的制備

2.1 對照品溶液的制備 取對照品熊果酸4.99 mg，加無水乙醇溶解定容到10mL作為對照品溶液，濃度為0.499 mg/mL〔8〕。

2.2 樣品溶液的制備 取本品約10 g，精密稱定，加水50mL使溶解，離心10min，傾去上層溶液，藥渣加水80mL洗滌，離心20min，傾去上層溶液，于100℃干燥至松軟粉末，連同濾紙一并放入索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流4 h，提取液回收乙醚至干，殘?jiān)?0mL石油醚浸泡兩次，每次2 min，傾去石油醚，殘?jiān)萌燃淄?無水乙醇（2∶3，V/V）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，搖勻，作為樣品溶液。

2.3 陰性對照液的制備 按處方制備不含酒萸肉的丸劑，再按供試品溶液的制備方法制成陰性溶液。

3 方法及結(jié)果

3.1 高效液相色譜條件的選擇

3.1.1 測定波長的選擇 取熊果酸對照品溶液適量，以無水乙醇為空白，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行掃描，見圖1。結(jié)果表明，熊果酸在210 nm處有最大吸收。

圖1 對照品紫外吸收光譜掃描圖

3.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent XBP-C18（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水（75∶15∶10，V/V），流速1mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：210 nm。對照品和明目地黃丸樣品的HPLC色譜圖見圖2和圖3。

圖2 對照品（1-熊果酸）

圖3 樣品（1-熊果酸）

3.2 薄層掃描法展開劑、掃描方式及波長的選擇

3.2.1 展開劑 環(huán)己烷-氯仿-醋酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.5，V/V），展距8～10 cm，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液。

3.2.2 掃描方式 采用反射法鋸齒掃描，狹縫0.4mm×0.4mm。

3.2.3 掃描波長的選擇 吸取對照品溶液、樣品溶液、陰性對照品溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一薄層板上，展開。取出，晾干，顯色，110℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰（約4～5min），在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定。薄層板置CS-930薄層掃描儀上在250～730 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯色后的熊果酸在540 nm處有最大吸收，樣品圖譜與對照品一致，而陰性對照品在540 nm處幾乎無吸收，故選擇540 nm為測定波長，700 nm為參比波長。

3.3 線性關(guān)系考察

3.3.1 HPLC 分別取0.499mg/mL的熊果酸對照品溶液2，5，8，10，15，18，20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=50 957X-14.851，r=0.999 7，熊果酸在0.998~9.980μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.2 TLCS 分別吸取對照品溶液2，4，6，8，10 μL點(diǎn)于薄層板上。按“3.2.3”項(xiàng)色譜條件展開，晾干，顯色，掃描，以熊果酸的量（μg）對峰面積求回歸方程，得Y=77 594X-289.2，r=0.998 2，熊果酸在0.998~4.990μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。結(jié)果表明HPLC比TLCS的線性范圍廣、線性關(guān)系更好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

3.4.1 HPLC 取同批樣品（云南龍發(fā)制藥100201），按照“2.2”項(xiàng)的方法處理樣品5份，按“3.1.2”色譜條件進(jìn)樣10μL，結(jié)果見表1。

3.4.2 TLCS 取同批樣品（云南龍發(fā)制藥100201），按照“2.2”項(xiàng)的方法處理樣品5份，按“3.2”的方法測定熊果酸含量，結(jié)果見表1。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.5.1 HPLC 取同一熊果酸對照品溶液，按“3.1.2”項(xiàng)條件每隔1 h測定一次，計(jì)算峰面積變化的RSD，結(jié)果見表2。

3.5.2 TLCS 吸取一定量對照品溶液點(diǎn)于薄層板上，按上述薄層色譜掃描條件展開，晾干，顯色后每隔1 h掃描一次峰面積，計(jì)算峰面積變化的RSD，結(jié)果見表2。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果表明，在相同時(shí)間內(nèi)，HPLC的穩(wěn)定性更好，而TLCS在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的六味地黃丸適量，按表3加入0.499mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)方法處理。

3.6.1 HPLC 按“3.1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10μL測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)

3.6.2 TLCS 按“3.2”項(xiàng)方法測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。由表3可看出HPLC較TLCS回收率高，RSD較小。

4 樣品含量測定

取不同廠家，不同批號的樣品按照“2.2”項(xiàng)的方法處理。HPLC：按“3.1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10μL，TLCS：按“3.2”項(xiàng)測定，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定

由結(jié)果可看出，HPLC的RSD較TLCS小，結(jié)果更為準(zhǔn)確。

5 結(jié)果與討論

通過對HPLC與TLCS測定明目地黃丸中熊果酸的含量比較研究，HPLC在精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率等方面均較TLCS好。

由于熊果酸與齊墩果酸結(jié)構(gòu)相近，采用TLCS難以將其分離，造成測定結(jié)果偏高，但采用HPLC，二者可完全達(dá)到基線分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀可靠，因此HPLC比TLCS更加適合用于明目地黃丸中熊果酸的含量測定。

〔1〕孫曉菊，胡軍林.雙波長薄層掃描法測定明目地黃丸中熊果酸的含量〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2001，12（12）：1078-1079.

〔2〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部〔M〕.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：492-493.

〔3〕查志堅(jiān).明目地黃丸治療寒冷性過敏淺識〔J〕.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2008，22（6）：99.

〔4〕宋立，王笑蓮.明目地黃丸治療干眼癥臨床觀察〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（8）：747-748.

〔5〕李種泰.明目地黃丸配針灸穴位注射治療視網(wǎng)膜色素變性29例〔J〕.陜西中醫(yī)，2005，26（11）：1178-1179.

〔6〕國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：815-816.

〔7〕楊劍芳，路福平，高文遠(yuǎn)，等.HPLC法測定山茱萸及其浸泡酒中熊果酸和齊墩果酸總量〔J〕.釀酒科技，2007（11）：100-103.

〔8〕趙君操，李寧.山茱萸皮、肉、果實(shí)部位的熊果酸含量比較〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（11）：950-951.

（責(zé)任編輯 蔣 康）

Comparison of Determ ination Method of Ursolic Acid in Mingmudihuang Pill

XIAO Peiyun，YANG Yongshou，XU Jiaqiang
（College of Pharmacy,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To improve a newmethod for the determination of ursolic acid in Mingmudihuang pill.Methods:The content of ursolic acid was determined by HPLC and TLCS.Results:The linear rangewas 0.998-9.980 μg（r=0.999 7）for ursolic acid at the HPLC and the linear relation was good.At the TLCS the linear range was 0.998-4.990μg（r=0.998 2）and the linear relation was good.Conclusion:The HPLC is simpler,more rapid and accurate,and can better control the quality of Mingmudihuang pill than the TLCS.

Mingmudihuang pill;HPLC;TLCS;ursolic acid

R944

B

1672-2345（2010）12-0004-03

2010-07-12

肖培云，副教授，主要從事中藥材及其制劑質(zhì)量控制研究.