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    堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在大鼠哮喘氣道重塑模型中的表達(dá)及地塞米松的干預(yù)作用

    2010-09-21 06:12:42鞏雪芳薄建萍陳俊艷
    當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2010年4期
    關(guān)鍵詞:平滑肌重塑氣道

    鞏雪芳 薄建萍 陳俊艷

    大量的研究證明許多成纖維細(xì)胞因子(fibroblast growth factors,F(xiàn)GFs)在慢性炎癥和組織重塑進(jìn)程以及慢性氣道疾病如哮喘的纖維化中起作用[1]。堿性成纖維細(xì)胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是FGFs龐大家族中的一員,而且是在哮喘病理生理學(xué)中研究最多的一員。這個(gè)生長(zhǎng)因子最早在牛垂體抽提物中發(fā)現(xiàn),基于其刺激成纖維細(xì)胞細(xì)胞株NIH3T3增殖的能力及其高等電點(diǎn)(PI=9.6)而得名[2]。它在血管發(fā)生過程中血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞的增殖,損傷愈合過程中成纖維細(xì)胞的遷移和增殖,成肌纖維細(xì)胞表型的逆轉(zhuǎn),以及氣道上皮細(xì)胞的遷移和增殖中起作用[3]。本文通過觀察在不同程度氣道重塑情況下血清中bFGF含量的變化,探討bFGF與氣道重塑嚴(yán)重程度的相關(guān)性及地塞米松干預(yù)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器 彩云JWC-201D型超聲霧化器:鞍山市同信醫(yī)用儀器廠;BH-2型光學(xué)顯微鏡:日本Olympus公司;LY-SUPER HP CCD萬能成像裝置:成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司;80-2B型低速臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;ZS-2板式酶標(biāo)儀:北京新風(fēng)機(jī)械廠;IMS6.0彩色圖像分析系統(tǒng):上海申騰信息技術(shù)有限公司。

    1.1.2 試劑 卵白蛋白(Ovalbumin,OVA):美國(guó)Sigma公司;氫氧化鋁(Aluminum hydroxide,Al(OH)3):天津化學(xué)試劑三廠;bFGF ELISA試劑盒:美國(guó)R&D systems公司。

    1.1.3 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠40只,2~3月齡,體重160~180g,清潔級(jí),購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫20℃飼養(yǎng),自由進(jìn)食與飲水。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為早期干預(yù)組(early-intervention group)、晚期干預(yù)組(lateintervention group)、不干預(yù)組(non-intervention group)及對(duì)照組(control group),每組10只。

    1.2.2 模型建立 實(shí)驗(yàn)第1天,E組、L組和N組每只大鼠腹腔注射10%卵白蛋白抗原混懸液(內(nèi)含生理鹽水加卵蛋白100mg,氫氧化鋁干粉100mg)1ml致敏;C組腹腔注射等量生理鹽水。8天后E組、L組和N組每只大鼠再次腹腔注射10%抗原混懸液1ml;C組腹腔注射等量生理鹽水。第15天,E組、L組和N組開始用1%卵蛋白超聲霧化吸入激發(fā)哮喘,每天1次,每次20min,共8周;C組用生理鹽水霧化吸入,每天1次,每次20min,共8周。其中,E組在每次霧化前1h,每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg;從霧化第15天始,L組在每次霧化前1h,每只大鼠首先腹腔注射地塞米松0.5mg/kg;C組用生理鹽水代替,注射劑量相同。

    1.2.3 標(biāo)本制備 每只大鼠于最后一次霧化后24h內(nèi)用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉,開胸,右心室取血約2ml,于室溫放置2小時(shí)后,1000r/min,離心10min,取上清液分裝,-20℃保存待測(cè)。同時(shí),取右肺中葉,4%多聚甲醛溶液中固定1周,常規(guī)石蠟包埋,切片,做HE染色。

    1.2.4 圖像分析 HE染色切片上100倍光鏡下選擇完整支氣管橫斷面測(cè)量支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管總面積(At)、管腔面積(Ac)、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積(AMe)、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積(AMi)。

    計(jì)算公式:

    支氣管壁厚度=(At-Ac)/Pbm

    平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm

    衡量氣道重塑程度[4]。

    1.2.5 檢測(cè)血清bFGF水平 使用ELISA法,按試劑盒說明測(cè)定血清中bFGF濃度值。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),兩個(gè)變量間的關(guān)系采用線性相關(guān)分析,結(jié)果用(±s)表示,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況觀察 N組、E組、L組大鼠初次霧化結(jié)束時(shí)即出現(xiàn)大汗淋漓,口唇輕度紫紺,腹部翕動(dòng),煩躁不安,易激惹,飲水增加。C組大鼠行動(dòng)敏捷,未見異常。

    2.2 計(jì)算機(jī)圖像分析

    2.2.1 HE染色形態(tài)學(xué)改變 N組肺組織中支氣管上皮細(xì)胞脫落,支氣管黏膜皺襞增多,中斷,呼吸道壁增厚,管腔狹窄,黏膜下、管壁及肺泡間質(zhì)均見有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主);E組支氣管上皮結(jié)構(gòu)基本正常,上皮細(xì)胞偶有脫落,黏膜相對(duì)完整,呼吸道壁增厚及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯輕于N組;L組的變化介于上述兩組之間;C組肺組織中幾乎無上述病理改變。

    2.2.2 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度測(cè)定(表1)

    2.3 血清中bFGF濃度(見表2,3)

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

    2.4.1 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度比較 各組大鼠支氣管壁厚度數(shù)據(jù)由方差分析得F=518.49,P<0.01;進(jìn)一步經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),任何兩組間支氣管壁厚度上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣,各組大鼠氣道平滑肌厚度數(shù)據(jù)由方差分析得F=271.26,P<0.01;進(jìn)一步經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),任何兩組間支氣管壁厚度上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4.2 各組大鼠血清中bFGF濃度比較 由方差分析得F=132.70,P<0.01;進(jìn)一步經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),任何兩組間血清中bFGF濃度上的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4.3 各組大鼠血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度及平滑肌厚度之間的關(guān)聯(lián)性分析 繪散點(diǎn)圖知,血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度呈線性趨勢(shì),Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.93(t=6.16,P<0.001),表明血清中bFGF濃度與支氣管壁厚度間呈線性正相關(guān);同樣,繪散點(diǎn)圖知,血清中bFGF濃度與平滑肌厚度也呈線性趨勢(shì),Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.95(t=18.75,P<0.001),表明血清中bFGF濃度與平滑肌厚度間也呈線性正相關(guān)。

    表1 各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度(μm,±s)

    表1 各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度(μm,±s)

    分組 n 支氣管壁厚度 平滑肌厚度N組 10 139.34±5.80 36.93±1.52 E組 10 101.53±2.33 22.22±1.32 L組 10 117.77±1.20 29.24±0.97 C組 10 80.19±2.79 18.47±2.19

    表2 各組大鼠血清中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的濃度(±s,ng/ml)

    表2 各組大鼠血清中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的濃度(±s,ng/ml)

    分組 n 血清中bFGF含量(ng/ml)N組 10 0.53±0.04 E組 10 0.34±0.02 L組 10 0.43±0.03 C組 10 0.30±0.03

    表3 各組大鼠血清中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)濃度的變異度

    3 討論

    哮喘氣道重塑最重要的病理變化是上皮剝脫、杯狀細(xì)胞化生、上皮下肥厚、氣道平滑肌增生、支氣管腺體肥大、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分改變[5]。在這些病理變化中,氣道平滑肌增生是哮喘氣道重塑最顯著的特征[6]。有研究表明,bFGF誘導(dǎo)哮喘氣道平滑肌增生[2],通過增加人氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移、改變其收縮性表型在哮喘氣道重塑中起重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)中,從早期干預(yù)組、晚期干預(yù)組至不干預(yù)組,氣道重塑程度(支氣管壁厚度、平滑肌厚度)逐漸增加,而bFGF濃度也呈上升趨勢(shì),提示bFGF與哮喘氣道重塑嚴(yán)重程度相關(guān),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩者呈線性正相關(guān),由此推測(cè)bFGF未來可能成為評(píng)價(jià)氣道重塑程度、診斷和治療哮喘氣道重塑的關(guān)鍵因子。在哮喘治療中糖皮質(zhì)激素是最有效的抗炎藥物[7],在本實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用地塞米松后,早期干預(yù)組氣道重塑程度明顯較晚期干預(yù)組及不干預(yù)組為輕,提示早期地塞米松治療可部分逆轉(zhuǎn)哮喘氣道重塑,其可能通過下調(diào)bFGF起作用。另外本實(shí)驗(yàn)中,早期應(yīng)用地塞米松效果明顯,可預(yù)見用藥時(shí)機(jī)的選擇是治療哮喘氣道重塑的關(guān)鍵之一,在未來可考慮檢測(cè)哮喘患者血清bFGF來指導(dǎo)臨床用藥,從這個(gè)意義上來說,本實(shí)驗(yàn)可作為一個(gè)初步參考,一個(gè)因子要作為診斷標(biāo)準(zhǔn)還需進(jìn)行大量臨床工作,且本實(shí)驗(yàn)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn),要在人群中明確bFGF是否為哮喘氣道重塑的關(guān)鍵因子也需要進(jìn)一步的臨床研究。

    [1]Zou Hui,Nie Xiu-hong,Zhang Yi,et al.Effect of basic fibroblast growth factor on the proliferation,migration and phenotypic modulation of airway smooth muscle cells[J].Chin Med J,2008,121(5):424-429.

    [2]Ynuk Bossé,Marek Rola-Pleszczynski.FGF2 in asthmatic airwaysmooth-muscle-cell hyperplasia[J].Trends Mol Med,2007,14(1):3-11.

    [3]Seong Gyu Jeon,Chun Geun Lee,Min-Hee Oh,et al.Recombinant basic fibroblast growth factor inhibits the airway hyperresponsiveness,mucus production,and lung inflammation induced by an allergen challenge[J].J Allergy Clin Immunol,2007,119:831-837.

    [4]王傳夏,李昌崇,羅運(yùn)春,等.支氣管哮喘大鼠氣道重塑中肺泡巨噬細(xì)胞的作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2006,29(11):740-743.

    [5]Thais Mauad,Elisabeth H.Bel,Peter J.Sterk.Asthma therapy and airway remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2007,120:997-1009.

    [6]Etsuko Tagaya,Jun Tamaoki.Mechanisms of Airway Remodeling in Asthma[J].Allergol Int,2007,56:331-340.

    [7]David H,Broide.Immunologic and inflammatory mechanisms that drive asthma progression to remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2008,121:560-570.

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