番茄葉霉病生理小種研究進展

洪 瑞，李景富

（東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

番茄葉霉病是番茄生產中普遍發(fā)生的一種真菌性病害，尤其是在保護地內，多濕的特殊小氣候條件有利于病原菌的生長，使危害更為嚴重，同時在一些濕度始終很高的露地危害也相當嚴重。該病自番茄幼苗期就可以發(fā)生，直到結果后期均能發(fā)病。病原菌以菌絲體附著在保護地設施或土壤中的病殘體上，也可潛伏在種皮中或以分生孢子附著在種子表面越冬。第二年遇適宜條件即可產生分生孢子借氣流傳播成為主要的侵染來源，引起初次侵染[1]。據歷年調查統計，由番茄葉霉病引起的產量損失達10%～25%，流行年份達50%以上，一些嚴重地塊甚至絕收[2]。番茄葉霉病是危害番茄生產的一種重要病害，是全世界番茄研究者的研究熱點。本文對番茄葉霉病病菌的生理小種情況進行了綜述，從而為研究抗病品種及品種布局提供依據，有效地預防番茄葉霉病的發(fā)生及進行有針對性的抗病育種。

1 Cladosporium fulvum生理小種的命名及鑒別方法

1.1 C.fulvum生理小種的命名

依據Ainsworth分類系統，番茄葉霉病的病原為褐孢霉（Fulvia fulva（Cooke）Cif），異名為Cladosporim fulvum Cooke。屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、褐孢霉屬真菌[3]。關于番茄葉霉病菌生理小種命名方法各國不盡相同。加拿大根據生理小種的發(fā)現時期來命名：能克服Cf1基因命名為生理小種1，能克服Cf2基因命名為生理小種2，能同時克服Cf1、Cf2、Cf3基因命名為生理小種6，能克服Cf4基因命名為生理小種10，能克服Cf2、Cf3、Cf4基因命名為生理小種12。而在荷蘭，有學者試圖根據其相應的抗性基因進行系統的分類命名，將這些復雜的小種分為A、B、C、D、E等5個類群，每一類群都含有大量小種：凡是能克服Cf1、Cf2、Cf3單獨或復合基因的列入A群；能克服Cf4基因或同時又能克服Cf1、Cf3基因列入B群：能克服Cf2、Cf4基因或同時又能克服Cf1、Cf3基因列入C群；能克服Cf5基因的生理小種被列入D群[4]。目前國內外比較通用也是我國采用的命名方法是參照N.Hubbeling氏葉霉病生理小種分化表仿P.Day氏分類法來劃分各菌株生理小種歸屬。

1.2 C.fulvum生理小種的鑒定

鑒別生理小種不是根據形態(tài)而是根據生理特性，其中主要是依據致病力，也就是通過鑒別寄主譜來鑒定；另外還可以通過分子標記的方法進行鑒定。

1.2.1 鑒別寄主譜鑒定

通過寄主譜鑒定生理小種是一種傳統模式，根據它們對寄主種或不同基因型品種的致病性的?；?，應用一系列含單抗基因的鑒別寄主對菌株進行分類[5]。國內外根據菌株在一套通用的含有單基因的鑒別品種上的反應來識別其生理小種類型[6]。對于番茄葉霉病生理小種的鑒定，國際上有一套完善的通用的葉霉病生理小種鑒別寄主譜，它是由7個含不同抗性基因的番茄品種組成：即，Moneymaker、Leaf Mould Resister、Vetomold、VI21、Ont7516、Ont 7717、Ont7719，分別含有 Cf0、Cf1、Cf2、Cf3、Cf4、Cf5和Cf9純合的抗葉霉病基因，其中Cf0是不含任何抗性基因的普通感病品種[7]?，F已克隆得到了番茄抗葉霉病菌的Cf2、Cf4、Cf5、Cf9、Cf-ECP9基因和葉霉病菌的無毒基因Avr9、Avr4及Avr2 等[8]。

將經過純化的病原菌接種鑒別寄主譜，依據番茄葉霉病鑒定分級標準計算病情指數，然后參照N.Hubbeling氏葉霉病生理小種分化表仿P.Day氏分類法來劃分各菌株生理小種歸屬。實踐證明這種方法操作簡單，便于推廣應用，但同時也存在著不足，諸如勞動量大，浪費時間；鑒定結果會因濕度、溫度、接種技術等存在差異；用于鑒別的病原菌可能由于采集時間、地點等的不同，成為影響鑒定結果的一個主觀因素。往往由于這些因素而影響鑒定結果的準確性。

1.2.2 分子標記鑒定

隨著生物技術的日益發(fā)展，分子標記技術也逐漸應用到病原菌基因多樣性的研究中來。韓文華等利用酯酶同工酶圖譜分析番茄葉霉病菌生理小種，結果顯示，酯酶同工酶的分析可在一定程度上反映出病原菌的變異與分化。相同的生理小種間基本上有相似的酶譜，此種方法可以作為生理小種鑒定的輔助方法[9]；于栓倉等對番茄葉霉病3個主要生理小種進行RAPD標記鑒定，將3個生理小種完全區(qū)分開來[10]。

有些研究者根據對菌株致病型差異與DNA指紋差異的一致性研究結果，提出擺脫鑒別品種（系），建立劃分小種的新方法。多數學者認為二者相輔相成，缺一不可。離開常規(guī)的生理小種鑒定，分子生物學的小種研究無從進行，其研究結果也無法得到驗證。另一方面，常規(guī)的生理小種鑒定和研究需要借助生物技術方法，使研究工作深化，在Flor的“基因對基因”學說指導下[11]，共同揭示葉霉病菌致病性分化和變異的本質。二者的結合將為番茄的抗葉霉病育種和葉霉病防治提供科學的指導[12]。

2 C.fulvum生理小種時、空間分布變化規(guī)律

番茄葉霉病菌具有明顯的生理分化現象，能分化出許多生理小種，而且具有時空變異的特點，是目前蔬菜病害中病菌分化最明顯的病害之一[13]。

2.1 國外番茄葉霉病生理小種分化概況

早在1883年葉霉病在歐洲就有發(fā)生的記載，20世紀30年代，歐美等國番茄葉霉病以生理小種0為主，之后相繼分化出1.2、2.3和1.2.3等小種。在1964、1966和1968年間加拿大等國家發(fā)現了能夠侵染Cf4基因的高毒性生理小種群[14]。1977年報道時，已增至了13個生理小種，抗病基因也由6個增加為11個[15]。國外在番茄生產中應用抗葉霉病品種較早，因此，葉霉菌生理小種分化處于較高的層次。截至1990年，在荷蘭、法國、波蘭等歐洲國家就出現葉霉病菌生理小種2.5、2.4.11、2.4.5.11和2.4.5.9.11等分化層次較高的小種[16]。據加拿大、荷蘭等國研究報道，此病菌對Cf1～Cf5的5個抗葉霉病基因能分化出12個以上的生理小種，其中有些小種的致病力可使含有2～4個抗性基因的品種感病。迄今為止，世界上報道的番茄葉霉病病菌生理小種有13個，發(fā)現的抗病基因至少有24個，目前已被育種專家應用的有10個以上。

2.2 國內番茄葉霉病生理小種分化概況

和歐美等國家相比，中國番茄葉霉病具有更小的選擇壓力，生理小種分化基本上處于較低階段[17]。但是伴隨著番茄抗病品種相繼選育并推廣應用，病原菌攻克了原始的一些初級寄主，逐漸分化出新的小種。表1列出了我國近幾年來各省市地區(qū)番茄葉霉病生理小種的分化情況。

表1 各省市地區(qū)番茄葉霉病生理小種的分化情況Table1 Differentiation of physiological race in tomato leaf mould in China

由表1可知，番茄葉霉病菌從發(fā)現至今近60年的時間里生理小種發(fā)生了激烈的變化。造成生理小種快速分化及品種抗性迅速喪失的原因，除病原菌本身特性外，還有一些人為因素，種植者和育種家共同加快了抗病品種的更新換代。要想培育出一個適用于葉霉病嚴重發(fā)生地區(qū)的品種，至少應轉入2個抗葉霉病生理小種的基因，避免育成品種抗性維持幾年就喪失，從而也避免了時間、人力、物力等資源的浪費[32]。

3 番茄葉霉病抗病育種

番茄葉霉病是一種典型流行病害，在一個生長季節(jié)中可以發(fā)生多次再侵染，同時品種間具有明顯的抗性差異，因此利用抗病品種防治葉霉病是最經濟有效的方法[33]。番茄葉霉病抗性受顯性單基因控制，抗病性為顯性，屬于垂直抗性，大多表現為質量性狀遺傳。在進行抗病育種前，首先要選擇合理的抗源，往往能起到事半功倍的效果。野生番茄主要是被作為對重要病害的抗源加以利用，野生番茄主要有醋栗番茄（L.pimpinellifolium）、多毛番茄（L.hirsutum）、潘那利番茄（L.pennellii）、秘魯番茄（L.peruvianum）、多腺番茄（L.glandulosum）等。通過與野生番茄進行雜交可把抗病基因轉入到栽培番茄中[34]。另外，引進國外高抗基因抗源材料也是我們獲得抗病基因的來源。東北農業(yè)大學番茄課題組共鑒定抗葉霉病育種材料57份，篩選出對1.2.3.4株系免疫材料5份，對1.2.3株系高抗10份，抗病15份[35]。這些種質資源在改良番茄的抗病蟲性、增強對不良環(huán)境的忍耐力、改良果實品質及其他有價值的特性方面發(fā)揮重要作用，使番茄的開發(fā)利用具有廣闊前景。

國外培育的抗番茄葉霉病的品種很多，主要以含Cf5或Cf9基因為主[36]。美國育種專家用醋栗番茄和秘魯番茄作抗病親本，分別育成抗葉霉病高抗品種[37]。日本利用BayState系統育成了興津7-12號、風楊、揚子七福等品種；用STEP系統育成了田面、雷電、八方等品種[38]。我國番茄抗葉霉病育種研究比較晚，但取得了不錯的成果，東北農業(yè)大學番茄研究所育成了佳人和710等番茄抗葉霉病品種。

4 問題及展望

葉霉病菌致病性的頻繁、易變性增加了抗病育種的難度。但是隨著保護地番茄栽培面積的不斷擴大，培育抗葉霉病的品種依然是控制該病發(fā)生和蔓延的最有效途徑[17]。采用抗病品種時，一個值得注意的問題是品種的抗性喪失。目前，培育的抗病品種都屬于垂直抗性品種，因此連續(xù)大面積種植極易導致小種變異，產生新優(yōu)勢小種，使品種抗性喪失，造成極大危害。故利用抗病品種防治病害必須注意抗源品種的合理布局和輪換，以保證防病效果的穩(wěn)定和持久[13]。

隨著生物技術的迅猛發(fā)展和分子標記的日臻完善，建立在DNA基礎之上且不受環(huán)境影響的分子標記技術，已逐漸應用于植物育種中。番茄作為一種模式植物，有著得天獨厚的特點，分子標記技術發(fā)展和番茄連鎖圖譜的日趨飽和，使番茄上一些重要病害的抗病基因得以精細定位，這不但為建立完善的番茄抗病基因輔助選擇體系提供了可能，而且為抗病基因的分離和克隆提供了機會，在此前提下，迫切需要研究病原菌的變異規(guī)律，即研究番茄葉霉病生理小種的演變過程，這對于番茄抗病育種具有十分重要的意義。今后我國番茄分子育種將在重要抗病基因發(fā)掘與抗源種質發(fā)掘創(chuàng)新、重要抗病基因分子標記輔助轉育與聚合、分子育種策略研究與技術創(chuàng)新等方面進一步加強研究和利用。

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