奶牛乳腺發(fā)育與泌乳過程中能量代謝的變化

任立杰，佟慧麗，李慶章，高學軍

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030）

謝規(guī)律可以為調節(jié)奶牛乳腺發(fā)育能量負平衡，提高奶牛生產性能提供重要的理論基礎。一般對奶牛能量代謝的研究往往停留于脂肪酸、氨基酸等物質的營養(yǎng)調控與奶牛乳腺發(fā)育泌乳能量代謝水

能量是高產奶牛發(fā)揮泌乳潛力的重要因素，能量攝入量不足是影響高產奶牛泌乳量和乳品質的因素之一，特別是高產奶牛泌乳初期，能量代謝往往處于負平衡。研究奶牛乳腺發(fā)育的能量代平的關系[1-3]。目前，一些研究者對小鼠不同發(fā)育時期乳腺組織中的能量代謝相關酶的表達變化進行了系統(tǒng)的測定[4-5]。Rudolph等同時對乳腺中一些酶作用的底物如α-和β-型的葡萄糖、乳糖、半乳糖濃度進行了測定[5]。糖和脂肪是重要的能源物質，其中三羧酸循環(huán)、糖異生、糖酵解、磷酸戊糖途徑及脂肪酸氧化等代謝途徑與能量代謝有密切關系。而代謝途徑中的酶作為生物反應的催化劑，其相對數(shù)量決定代謝反應的進程和方向，對代謝過程具有重要的調節(jié)作用。本研究旨在通過對奶牛乳腺各個發(fā)育時期重要代謝途徑的關鍵酶及重要代謝產物的系統(tǒng)研究揭示奶牛乳腺發(fā)育與泌乳能量代謝的規(guī)律，為奶牛泌乳調控技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用乳腺組織來自澳洲進口健康荷斯坦奶牛，飼養(yǎng)于東北農業(yè)大學畜牧高新技術園區(qū)。根據(jù)奶牛乳腺發(fā)育的特點，分別在青春期2個月（V2M）、12個月（V12M）、14個月（V14M）；妊娠期2個月（P2M）、4個月（P4M）、6個月（P6M）；圍產前期（WC）；泌乳期 7 d（L7 d）、50 d（L50 d）、140 d（L140 d）、280 d（L280 d）、退化期 3 d（I3 d）、30 d（I30 d）4個時期共設立13個取樣點各剖殺1頭奶牛取乳腺組織，乳腺組織采集后，DEPC水沖洗，迅速轉入DEPC處理過的凍存管中，液氮凍存后轉入-80℃冰箱備用。

1.2 試劑

己糖激酶（Hexokinase，HK）測試盒（南京建成）；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-Phosphatase Dehydrogenase，G-6-PD）活性終點比色法定量檢測試劑盒（上海杰美）；異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate Dehydrogenase，ICDH）活性檢測試劑盒（上海杰美）；葡萄糖（Glucose，Glu）測定試劑盒（南京建成）；乳糖（Lactose，LAC）標準品購自天津軍事醫(yī)學科學院；ATP酶測定試劑盒（南京建成）；甘油三酯（Triglyceride，TG）測定試劑盒（南京建成）；牛β-酪蛋白（β-casein）標準品（Sigma）；其他常規(guī)實驗藥品及試劑為國產分析純。

1.3 設備

ZHJH-1112垂直流超凈工作臺；上海智城分析儀器制造有限公司；LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津；2695-2996型HPLC色譜儀，美國Waters；Delta-600-2487制備型HPLC色譜儀，美國Waters；SBA系列生化分析儀，賽諾邁德醫(yī)學技術有限責任公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠。

1.4 方法

HK、G-6-PDH、ICDH、ATP酶活性、葡萄糖及TG的測定方法遵照試劑盒說明書進行，試驗中每個指標做3次重復，下同。

HPLC法測定乳糖的分泌情況方法參見文獻[6]；

HPLC法測定β-酪蛋白的分泌情況方法參見文獻[7]；

能荷、NADPH的測定方法參見文獻[8]。

1.5 結果統(tǒng)計

采用SigmaPlot 9.0軟件對相關試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并采用Excel軟件對統(tǒng)計分析后的試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結果與分析

2.1 己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶活性的檢測結果

己糖激酶活性在各個時期變化量不明顯，在退化期30 d時達到最高，在妊娠2個月時最低；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶表達活性在各個時期變化量較明顯，在泌乳7 d時最高，在妊娠2個月時最低；異檸檬酸脫氫酶活性在各個時期變化量較明顯，在泌乳7 d時最高，在妊娠4個月時最低（見圖1～3）。

圖1 己糖激酶（HK）活性檢測結果Fig.1 Detection results of HK activity

圖2 異檸檬酸脫氫酶（ICDH）活性檢測結果Fig.2 Detection results of ICDH activity

圖3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性檢測結果Fig.3 Detection results of G-6-PD activity

2.2 甘油三酯、葡萄糖、乳糖及β-酪蛋白含量的檢測結果

結果見圖 4～7。

圖4 甘油三酯（TG）含量檢測結果Fig.4 Detection results of TG content assay

甘油三酯含量在各個時期變化量不明顯，在圍產前期達到最高，在妊娠2個月時最低；葡萄糖含量在各個時期變化量較明顯，在青春期14個月時最高，在妊娠期2個月時最低；乳糖含量在各個時期變化量較明顯，在圍產前期達到最高，在青春期2個月時最低；β-酪蛋白含量在各個時期變化量較明顯，在退化3 d時達最高，在青春期2個月時最低。

圖5 葡萄糖（Glu）含量檢測結果Fig.5 Detection results of Glu content assay

圖6 乳糖（LAC）含量檢測結果Fig.6 Detection results of LAC content

圖7 酪蛋白（β-casein）含量檢測結果Fig.7 Detection results of β-casein content

2.3 ATP酶活性的檢測結果

Na+K+-ATP酶活性在各個時期變化量不明顯，在泌乳280 d時最高，在妊娠2個月時最低；Ca2+Mg2+-ATP酶活性在各個時期變化量不明顯，在泌乳140 d最高，在青春期2個月時最低（見圖8）。

圖8 ATP酶活性檢測結果Fig.8 Detection results of ATPase activity

2.4 能荷值和NADPH含量的檢測結果

組織能荷值在各個時期變化量不明顯，在圍產前期最高，在泌乳140 d時最低；NADPH含量在各個時期變化量不明顯，在妊娠4個月時最高，在青春期14個月時最低（見圖9、10）。

圖9 能荷含量檢測結果Fig.9 Detection results of Energy charge content

圖10 NADPH含量檢測結果Fig.10 Detection results of NADPH content

3 討論

3.1 青春期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

青春期乳腺導管和腺泡上皮細胞較少，主要為不規(guī)則的脂肪和結締組織。此時期乳腺組織發(fā)育較慢，能量代謝并不旺盛，因此目前還沒有對青春期奶牛乳腺能量代謝規(guī)律的系統(tǒng)研究。本研究通過對乳腺發(fā)育青春2個月、青春12個月至青春14個月這一階段的研究結果發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)的關鍵酶ICDH的活性在這一階段沒有顯著變化，而糖酵解途徑的關鍵酶HK和磷酸戊糖途徑的關鍵酶G-6-PD的活性呈現(xiàn)出增長的趨勢，結合青春期階段奶牛乳腺組織中的葡萄糖濃度高于妊娠期和泌乳期，推測可能與其作為相對單一的糖代謝主要物質有關，也可能是與其代謝消耗較少有關。

3.2 妊娠期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

妊娠期乳腺進一步發(fā)育，妊娠中期，合成乳糖和乳脂所需的酶開始出現(xiàn)[9]，妊娠晚期，在組織結構上接近于泌乳的乳腺。大量研究表明，妊娠期的乳腺發(fā)育決定了泌乳期分泌細胞的數(shù)量和后續(xù)的產乳能力[10]。NADPH常常存在于糖類代謝過程中。結果顯示P4M的NADPH最高，這可能是與乳腺快速發(fā)育所需的生物還原力有關。此時期物質和能量代謝逐漸旺盛。這與周貴等的報道相一致[11]。

3.3 圍產前期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

圍產期是奶牛整個的泌乳周期中最至關重要的一個時期，在這個階段，奶牛經歷了巨大的生理與代謝變化，抵抗力較差，故發(fā)病率要比泌乳中、后期均高，此時期奶牛亦需要大量能量。此時期甘油三酯、乳糖濃度和能荷較高。能荷是動態(tài)調節(jié)細胞能量平衡的一個參數(shù)[12]，也是含高能磷酸鍵的腺苷的比值，其作為測定細胞高能磷酸狀態(tài)的指標，可有效評估組織細胞的能量儲備狀態(tài)。此時其脂肪動員減弱，這與張光軍的報道相一致[13]，而本試驗亦測得此時期甘油三酯濃度較高。這一時期主要進行物質和能量貯備。能量貯備和攝食的調節(jié)與脂肪狀態(tài)調節(jié)食欲的理論相一致[14]，表明在奶牛的圍產期，能量的儲備與防止產后能量負平衡有密切關系。另有研究表明，圍產期增加能量攝入，對奶牛健康、泌乳及高產奶牛的再生產性能有積極作用[15]。

3.4 泌乳期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

泌乳期乳腺的發(fā)育達到頂峰，泌乳初期ICDH活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性較高，說明此時期代謝旺盛，主要進行磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)，提示泌乳期補充磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)途徑底物如葡萄糖等糖類物質及脂類等物質的重要性。這與劉國文等報道的高產奶牛在泌乳前幾周常存在能量負平衡[16]，此時母牛處于酮病和脂肪肝的危險期相一致，隨著泌乳期的延長，能荷和ICDH活性降低，供能分解代謝能力下降。提示應加強能量基礎物質補充。

3.5 退化期奶牛乳腺能量代謝變化規(guī)律

斷乳后，乳腺便停止分泌活動，進入退化期，腺泡上皮細胞開始凋亡。Mazurek等研究了小鼠乳腺退化時期的能量代謝情況，結果發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖和糖異生途徑的酶活性在乳腺組織退化的前期降低，同時 ATP、GTP、UTP、ADP、NAD、NADH和乳酸含量減少[4]。而糖酵解途徑的關鍵酶磷酸果糖激酶在乳腺退化的前期其活性仍保持較高的水平。本研究對奶牛乳腺退化初期代謝途徑的關激酶活性進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)HK作為糖酵解途徑的另一個關鍵酶，其在奶牛乳腺退化期高活性水平與小鼠乳腺的研究結果具有相似性，推測其可能與這一時期乳腺組織重建對分解代謝的能量與物質需求有關。

4 結論

本研究對乳腺組織中己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、甘油三酯、葡萄糖、乳糖、β-酪蛋白、ATP酶、能荷值和NADPH等指標進行了測定。結果表明，青春期14個月時葡萄糖濃度最高，妊娠4個月時NADPH含量最高，圍產前期時甘油三酯含量、乳糖含量和能荷值最高，泌乳7 d時異檸檬酸脫氫酶活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性最高，泌乳140 d時的Ca2+Mg2+-ATP酶的活性最高，泌乳280 d時的Na+K+-ATP酶活性最高，退化期3 d β-酪蛋白含量最高，退化期30 d時的己糖激酶活性最高。從而揭示了奶牛乳腺不同發(fā)育時期能量代謝的規(guī)律。

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