淫羊藿黃酮的高效液相色譜分析方法

朱 靖 博，邱 煥 杰，李 丹 鳳

（大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

淫羊藿（EpimediumHerb）又名仙靈脾，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。本品辛、甘，溫，入肝、腎經(jīng)，是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥［1］。臨床上，淫羊藿黃酮類化合物用于治療骨質(zhì)疏松癥的效果尤其顯著［2-4］。淫羊藿屬植物中的活性成分以黃酮類成分為主，大部分為8位具有異戊烯基取代的淫羊藿苷類黃酮成分［5］。2005 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定淫羊藿藥材質(zhì)量的控制指標(biāo)為淫羊藿苷。

高效液相色譜技術(shù)被認(rèn)為是中藥質(zhì)量控制的有效手段，黃朝瑜等以0.5%冰醋酸溶液和乙腈為流動(dòng)相，建立了淫羊藿藥材的指紋圖譜，共檢出7個(gè)峰［6］。郭青等得到了包括朝霍定A、B、C 以及淫羊藿苷一組峰的指紋圖譜［7］。易中宏等以乙腈-水-36%醋酸溶液梯度洗脫的HPLC法比較研究巫山淫羊藿的不同部位［8］。但由于微量成分分離和標(biāo)準(zhǔn)樣品缺乏等方面原因，以往HPLC 分析中對(duì)每個(gè)黃酮的定量分析研究較少。王麗霞以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)，對(duì)不同淫羊藿屬9個(gè)共有峰做了相對(duì)峰面積的分析［9］，但未進(jìn)行定量分析。

利用HPLC對(duì)樣品每個(gè)色譜峰進(jìn)行定性、定量分析已成為中藥質(zhì)量控制的主要手段［12］。但標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的缺乏是制約這類方法應(yīng)用于定量分析的主要因素。本實(shí)驗(yàn)旨在建立以淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品為參照物，對(duì)其他淫羊藿黃酮進(jìn)行相對(duì)定量，得到其他淫羊藿黃酮的相對(duì)含量，從而得到淫羊藿總黃酮的相對(duì)含量的方法，以期在一定程度上反映淫羊藿水提物的內(nèi)在質(zhì)量，為控制以淫羊藿黃酮為活性物質(zhì)的藥材及藥品質(zhì)量提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

DIONEX UltiMate3000高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司；P680 泵；ASI1000自動(dòng)進(jìn)樣器；PDA100檢測(cè)器；1810D 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海申生科技有限公司；UV-2102PC紫外可見光分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司。

乙腈，色譜純；甲醇、乙醇，分析純；水，雙重蒸餾水。

1.2 藥 品

淫羊藿苷對(duì)照品，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；淫羊藿提取物，購(gòu)自西安保賽生物工程有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：Sinochrom ODS-BP（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為雙重蒸餾水；乙腈濃度梯度：0～12min（20%～30%），12～20min（30%～36%），20～30 min（36%～58%）；洗脫時(shí)間：30min；體積流量：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.4 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品1.12mg于10mL容量瓶中，甲醇定容，質(zhì)量濃度為112μg/mL。分別取一定量標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋不同倍數(shù)，配成質(zhì)量濃度為70、56、22.4、11.2、2.24μg/mL 的溶液，按“1.3”色譜條件分別進(jìn)樣分析。

1.5 供試品溶液的制備

稱取淫羊藿水提物50g放置于2 000mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇500mL，60℃水浴鍋中提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液濃縮，10%乙醇溶解定容于500 mL 容量瓶，得10 mg/mL 溶液，用該溶液配制1mg/mL 溶液，0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液備用。

1.6 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)照品溶液在紫外分光光度儀上進(jìn)行掃描（190～400nm），確定淫羊藿黃酮類化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿苷的紫外吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)照品溶液紫外吸收光譜掃描的結(jié)果見圖1（190～400nm），從而確定淫羊藿黃酮類化合物的紫外吸收光譜最大吸收在為270nm。

圖1 淫羊藿苷紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of Icariin

對(duì)“1.4”制得的對(duì)照品溶液，通過(guò)液相色譜檢測(cè)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線形回歸方程：y=0.633 2x-0.390 8，R2=0.999 9。結(jié)果表明，在2.24～112μg/mL淫羊藿苷峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。

2.2 樣品分析

淫羊藿苷和供試品溶液色譜分離結(jié)果如圖2、3所示。圖2中淫羊藿苷純度為98.5%。該色譜條件對(duì)淫羊藿水提物進(jìn)行分離得到13個(gè)分離良好的色譜峰。圖3中的9號(hào)峰為淫羊藿苷。

圖2 淫羊藿苷HPLC圖Fig.2 Chromatogram of Icariin

圖3 淫羊藿黃酮HPLC圖Fig.3 Chromatogram of Epimedium Flavones

每種物質(zhì)都有其特定的紫外吸收光譜，其紫外吸收光譜由物質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定，類似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)其紫外吸收光譜具有相似性，所以紫外吸收光譜可作為定性的依據(jù)之一［10-11］。利用HPLC-PDA檢測(cè)13個(gè)色譜峰的紫外吸收光譜圖見圖4。從圖1和圖4可以看出，在該色譜條件下分離的13個(gè)峰，其紫外吸收光譜吸收與淫羊藿苷紫外吸收相同，可以推測(cè)這13個(gè)化合物都是淫羊藿黃酮類化合物。

圖4 淫羊藿黃酮HPLC1～13色譜峰紫外吸收波譜圖Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of peaks 1-13 of Epimedium Flavones Chromatogram

2.3 分析方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試品溶液在室溫下放置，按“1.3”色譜條件，分別在制備供試品后的0、5、10、15、20h，吸取20μL注入高效液相色譜儀，記錄淫羊藿13個(gè)黃酮化合物的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。峰面積RSD為1.43%～4.03%，保留時(shí)間RSD為0.011%～0.65%。結(jié)果表明樣品20h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

供試品溶液按“1.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄淫羊藿13個(gè)黃酮化合物的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。峰面積RSD為1.28%～4.16%，結(jié)果表明該方法具有良好的精密度。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按照“1.5”供試品溶液制備方法，重復(fù)制備5份樣品，按“1.3”色譜條件測(cè)定，記錄淫羊藿13個(gè)黃酮化合物的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。峰面積RSD為0.35%～3.67%，保留時(shí)間RSD為0.014%～0.46%。結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.4 回收率試驗(yàn)

移液管吸取1 mg/mL 的樣品1、1、2、2 mL于5、10、25、50 mL 容量瓶，用甲醇定容，即樣品分別稀釋了5、10、12.5、25 倍，再用移液管各取1mL分別與1 mL 的26μg/mL 的淫羊藿苷混溶，按“1.3”色譜條件測(cè)定，記錄淫羊藿苷的峰面積和樣品分析回收率，結(jié)果如表1所示。

表1 淫羊藿苷回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 The recovery rate of Icariin

2.3.5 各黃酮單體定量分析

取供試品溶液按“1.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣4次，記錄淫羊藿13個(gè)色譜峰的峰面積，代入線性回歸方程，即可得到每個(gè)黃酮單體相當(dāng)于淫羊藿甙的含量。結(jié)果如表2所示。

試驗(yàn)表明該淫羊藿提取物總黃酮質(zhì)量濃度約為244.184μg/mL，淫羊藿溶液的質(zhì)量濃度為1mg/mL，即淫羊藿提取物中以淫羊藿苷計(jì)的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.4%。

3 結(jié)論

（1）通過(guò)試驗(yàn)研究，建立了淫羊藿黃酮化合物HPLC分析方法。該方法分析時(shí)間短，樣品分離度高，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，為淫羊藿水提物及其制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

（2）以HPLC-PDA 聯(lián)用方法，確定這13 個(gè)峰都是淫羊藿黃酮化合物色譜峰。

（3）以淫羊藿苷為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)這13個(gè)黃酮化合物進(jìn)行了相對(duì)定量分析，結(jié)果顯示提取物以淫羊藿苷計(jì)的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為樣品總量的24.4%，該指標(biāo)可作為控制淫羊藿水提物質(zhì)量的參考。

表2 淫羊藿提取物中黃酮的質(zhì)量濃度Tab.2 The content of Icariin in Epimedium extract μg·mL-1