小鼠白細胞介素17A的克隆、表達及活性鑒定①

張 薇 高紅梅 葉賢龍 于藝雪 劉銘瑤 王文飛 任桂萍 李德山

(東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物制藥教研室,哈爾濱150030)

小鼠白細胞介素17A的克隆、表達及活性鑒定①

張 薇 高紅梅 葉賢龍 于藝雪 劉銘瑤 王文飛 任桂萍 李德山

(東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物制藥教研室,哈爾濱150030)

目的:克隆小鼠白細胞介素17A(mIL-17A)基因,構(gòu)建mIL-17A原核表達質(zhì)粒在E.coilRosetta(DE3)PlysS表達,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板,根據(jù)GenBank報道的mIL-17A序列設(shè)計引物,進行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的編碼序列并構(gòu)建到pMD18-T載體中,再亞克隆至原核表達載體pHisSUMO Express中,經(jīng)DNA測序鑒定后轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細胞,IPTG誘導表達,Western blot鑒定。純化后的蛋白處理3T3-L1前體脂肪細胞,real time PCR鑒定白細胞介素6(IL-6)的表達變化。結(jié)果:DNA測序證明所克隆基因序列與GenBank報道的完全一致。成功構(gòu)建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表達質(zhì)粒以包涵體形式表達了重組mIL-17A蛋白,且Western blot證實為目的蛋白。所得蛋白上調(diào)3T3-L1細胞表達IL-6。結(jié)論:獲得具有生物活性的mIL-17A蛋白,為進一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基礎(chǔ)。

小鼠白細胞介素17;克隆;表達;包涵體;活性鑒定

白介素17(Interleukin-17,即IL-17A)又叫細胞毒T淋巴細胞抗原-8,是新發(fā)現(xiàn)的一種前炎性細胞因子,主要由CD4+記憶T淋巴細胞、單核細胞等分泌,有強大的招募中性粒細胞的作用[1,2]。IL-17A的編碼基因在種屬間有較高的同源性,小鼠IL-17A和人IL-17A(hIL-17)分別定位于染色1(A12A4)和2(2q31)。此外,它的氨基酸序列在種屬間也有較高的同源性,一般均含有6個半胱氨酸、1個潛在的N端糖基化位點和2個磷酸化位點保守序列(分別是蛋白激酶C和酪氨酸激酶的潛在作用點)。成熟mIL-17A包含134個氨基酸,分泌形式為同源二聚體,在體內(nèi)還可以以寡聚體形式發(fā)揮作用[3]。IL-17A的受體廣泛分布在各種細胞表面[4]。

由于IL-17A與其受體結(jié)合后可誘導表達多種細胞因子和粘附分子,這些細胞因子在造血、炎癥、免疫的不同階段具有不同的功能,尤其在支氣管哮喘、類風濕性關(guān)節(jié)炎、器官移植和腫瘤中起重要的作用,現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究熱點[5]。為了進一步研究IL-17A的蛋白特性及生物活性,本實驗成功地克隆、表達并純化了具有生物活性的mIL-17A蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料 重組人IL-1β蛋白(rhIL-1β)(由本實驗室表達),E.coliDH5α、E.coliRosetta(DE3)PlysS、3T3-L1前體脂肪細胞(由東北農(nóng)業(yè)大學生命中心基因部保存)。pMD18-T試劑盒(購自TaKaRa公司),原核表達載體pHisSUMO Express(由本實驗室改造)[6],白介素-17A抗體(bs-1183R)(購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司),T4 DNA連接酶限制性內(nèi)切酶(購自NEB公司),高糖DMEM培養(yǎng)基(購自G ibco公司),新生牛血清(NCS,購自Hyclone公司),引物(由Invitrogen公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)GenBank報道的mIL-17A序列,利用軟件Primer Premier5.0設(shè)計引物如下:P1:5′-catgccatggcagcgatcatccctcaaagct-3′(劃線部分為NcoⅠ酶切位點);P2:5′-cgggatcc ttaggctgcctggcggacaat-3′(劃線部分為BamHⅠ酶切位點);P3:5′-tccagggagagcttcatctgtgtct-3′;P4:5′-tcagccgcgggtctctgttta-3′。取1.5 ml、0.02 mg/ml的rhIL-1β用等體積弗氏完全佐劑乳化后免疫3只小鼠,同樣方法于兩周后進行第二次免疫、三周后進行第三次免疫,將完成免疫的小鼠斷頸處死,取胸腺,研磨后收集細胞沉淀。提取總RNA,以O(shè)ligo(dT)18為引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA為模板,P3、P4為引物進行第一次PCR,退火溫度為55℃,20個循環(huán)。再以第一次PCR產(chǎn)物為模板,P1、P2為引物進行第二次PCR,退火溫度為60℃,20個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.2 表達質(zhì)粒pHisSUMO Express-mIL-17A的構(gòu)建 將上述PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體于16℃連接過夜,然后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。PCR鑒定pMD18-T-mIL-17A克隆,擴增并提取質(zhì)粒后,將其與pHisSUMO Express載體分別用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物進行連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。取經(jīng)SacⅠ酶切鑒定和測序證實的陽性重組質(zhì)粒擴增并轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細胞。PCR鑒定pHisSUMO Express-mIL-17A克隆。

1.2.3 重組mIL-17A的誘導與表達 將鑒定為陽性的重組工程菌接種于20 ml含100μg/ml Amp+的LB培養(yǎng)基中,37℃,150 r/min培養(yǎng)過夜。次日將活化了一次的菌液1%接種于500 ml含100μg/ml Amp+的LB培養(yǎng)基中,37℃,150 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.3時,加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L,誘導表達3小時,4 000 r/min離心30分鐘收集菌體。超聲破碎后,4 000 r/min離心30分鐘,分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE,分析表達情況。

1.2.4 重組mIL-17A的純化與鑒定 將誘導表達的菌體破碎后棄上清,用含有2 mol/L尿素的PBS洗滌包涵體兩次,然后用8 mol/L尿素4℃變性過夜,經(jīng)HiLoad 16/60 Superdex 75 pg(GE)柱上梯度復性,然后通過Hiprep 26/10 desalting(GE)脫鹽。將所得樣品進行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。

1.2.5 3T3-L1前體脂肪細胞的培養(yǎng) 復蘇3T3-L1細胞,在37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下,用含有10%新生牛血清NCS的高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的3T3-L1細胞以1×106細胞/孔的密度接種于六孔板上,當細胞達到80%～90%匯合時,饑餓處理12小時,檢測重組mIL-17A蛋白活性。

1.2.6 重組mIL-17A的活性鑒定 純化后的蛋白除菌后用培養(yǎng)液稀釋至終濃度為1.5、150、1 500 ng/ml。取2 ml上述稀釋液分別處理六孔板中的3T3-L1前體脂肪細胞,以未經(jīng)蛋白處理的細胞作為空白對照,以經(jīng)60℃水浴滅活的蛋白(用培養(yǎng)液稀釋至終濃度為1 500 ng/ml)處理的細胞作為陰性對照,每個濃度至少設(shè)3個重復孔。24小時后收集細胞,Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用real time PCR檢測mIL-6的表達量并做統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增 采用RT-PCR技術(shù)克隆得到成熟的mIL-17A基因片段,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小在400 bp左右(見圖1),與預(yù)計片段相符(402 bp),初步判定得到目的基因片段。

圖1 PCR擴增mIL-17A基因Fig.1 Amplification of mIL-17A by PCRfrom mouse thymus stimulated by the human IL-1β

2.2 表達質(zhì)粒pHisSUMO Express-mIL-17A的構(gòu)建pHisSUMO Express-mIL-17A經(jīng)酶切鑒定,結(jié)果如圖2,300 bp處即為目的基因與pHisSUMO Express載體連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α的陽性克隆。挑取經(jīng)測序證實的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Rosetta感受態(tài)細胞的單菌落經(jīng)PCR鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示有含有目的基因(見圖3),即為陽性的重組工程菌。

2.3 重組mIL-17A的誘導與表達 重組工程菌經(jīng)IPTG誘導表達、破碎后進行SDS-PAGE電泳鑒定,顯示破碎后的沉淀在14～18.5 kD間有目的帶(見圖4),與成熟mIL-17A分子量的理論值(15.5 kD)相符,即目的蛋白以包涵體形式表達。

圖2 酶切鑒定DH5α/mIL-17A克隆Fig.2 The confirmation of the DH5α/mIL-17A clone by RE enzyme digestion

圖3 PCR鑒定Rosetta/mIL-17A克隆Fig.3 The confirmation of Rosetta/mIL-17A clone by PCR

圖4 表達mIL-17A的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGEanalysis of expression of mIL-17A

2.4 重組mIL-17A的Western blot鑒定 將純化后的蛋白樣品(見圖5)與陰性對照BSA進行Western blot鑒定(見圖6)。經(jīng)顯影后在膠片上可見泳道2有唯一的條帶,而純化后的蛋白與商品化的IL-17A抗體有特異性反應(yīng),證實了所表達的蛋白是目的蛋白且純化效果良好。

2.5 重組mIL-17A的活性鑒定 3T3-L1前體脂肪細胞是一種鼠源的成纖維細胞,經(jīng)mIL-17A蛋白處理后可以上調(diào)其IL-6的表達量。所以本實驗利用real time PCR方法檢測經(jīng)重組mIL-17A蛋白處理后3T3-L1細胞的IL-6表達水平,結(jié)果顯示處理組較空白組IL-6表達水平差異顯著且成濃度劑量依賴,而陰性對照組與空白對照組IL-6表達水平差異不顯著(P=0.14,見圖7),即重組mIL-17A蛋白具有生物學活性。

圖5 純化后的mIL-17AFig.5 The purified mIL-17A

圖6 mIL-17A純化后的Western blot鑒定Fig.6 Western blot confirmation of the purified mIL-17A

圖7 mIL-17A刺激3T3-L1前脂肪細胞后real time PCR方法檢測IL-6的mRNA水平Fig.7 Real time PCR detection of the mRNA level of IL-6 in pre-adipocytes 3T3-L1 cells stimulated by mIL-17A

3 討論

研究表明,IL-17A及IL-17AR的抗體可以有效降低類風濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng),阻滯炎癥進展[7-9]。此外,在卵清蛋白(OVA)致敏小鼠激發(fā)前使用IL-17A單克隆抗體可以明顯減少中性粒細胞的浸潤,即拮抗IL-17A的作用有望改善慢性重度哮喘的氣道重建[10]。由于IL-17A在諸多炎癥疾病中均上調(diào)表達,因此人們希望通過阻斷其作用以達到治療的目的。對IL-17A生物活性的研究將為治療藥物的篩選提供理論基礎(chǔ),并起指導作用。

由于mIL-17A mRNA的表達部位與hIL-17A mRNA的表達部位有所不同:應(yīng)用Northern雜交未能在CD4+和CD8+胸腺細胞中檢測到IL-17 mRNA,用常規(guī)克隆hIL-17A的方法(通過PMA或LPS刺激T細胞制備PCR模板)克隆mIL-17A基因比較困難[3]。

在制備模板cDNA時,我們選取了三種方法:一是提取經(jīng)人IL-1β免疫的小鼠的胸腺RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板;二是分離小鼠胸腺細胞,用LPS刺激24小時后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板;三是分離小鼠脾臟細胞,用LPS刺激24小時后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板。以相同條件進行PCR,結(jié)果(未給出)顯示第一種方法較另外兩種更容易得到mIL-17A基因,為其基因的獲得提供了一種更為有效的方法。

在構(gòu)建原核表達質(zhì)粒時我們考慮到兩個方面:一是目的蛋白的高效、可溶性表達;二是盡量減少表達后的純化步驟。pHisSUMO Express載體經(jīng)Nco I和BamH I酶切后將除去SUMO標簽,目的蛋白將以高表達量的包涵體形式表達;而pHisSUMO Express載體經(jīng)BsaⅠ和BamHⅠ酶切,目的蛋白將與SUMO標簽以融合蛋白的形式表達,用SUMO蛋白酶消化后可得成熟的目的蛋白。因此構(gòu)建了無標簽和有標簽(結(jié)果未給出)兩種原核表達質(zhì)粒。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn),mIL-17A蛋白可以和鎳柱結(jié)合,可溶的SUMO-mIL-17A融合蛋白經(jīng)SUMO酶消化后的純化工作難度加大,而以包涵體形式表達就可以避免這個問題。經(jīng)過探索,我們用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg(GE)進行柱上復性,解決了包涵體復性困難的問題,并簡化了純化步驟,只需包涵體的洗滌、變性、復性及脫鹽四步便可得到大量、純度較高的、具有生物活性的目的蛋白。

由于本實驗是用E.coilRosetta(DE3)PlysS表達mIL-17A的,所以得到的蛋白中可能會有少量的內(nèi)毒素污染。據(jù)報道,60℃水浴不會對內(nèi)毒素產(chǎn)生影響,但會使mIL-17A蛋白失活。由于內(nèi)毒素等很多因素均可能刺激細胞產(chǎn)生炎性細胞因子,在測定其活性時,我們將重組mIL-17A蛋白經(jīng)60℃水浴滅活后作為陰性對照,不僅排除了內(nèi)毒素對活性實驗的影響,同時排除了除重組mIL-17A蛋白外其他因素對活性實驗的影響,較使用內(nèi)毒素刺激細胞作為陰性對照更為嚴謹。

本實驗摸索出了一套簡單、快速、高效制備mIL-17A的方法,成功制備了有生物活性的mIL-17A,為后續(xù)研究IL-17A的特性及其生物活性奠定基礎(chǔ)。

1 Yao Z,Painter S L,Fanslow W Cet al.Human IL-17:a novel cytokine derived from T cells[J].Immunol,1995;155(12):5483-5486.

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5 張景熙.IL-17與疾病相關(guān)的研究進展[J].國外醫(yī)學·免疫學分冊,2004;27(1):52-55.

6 姜媛媛,劉銘瑤,任桂萍et al.高效可溶性重組蛋白表達載體的構(gòu)建[J].生物工程學報,2010;26(1):121-129.

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[收稿2009-12-12 修回2010-04-06]

(編輯 許四平)

Cloning,expression and activity detection of mIL-17A

ZHANG Wei,G AO Hong-Mei,YE Xian-Long,YU Yi-Xue,LIU Ming-Yao,WANG Wen-Fei,REN Gui-Ping,LI De-Shan.
College of Life Science,Northeast Agriculture University,Harbin150030,China

Objective:To clone mouse interleukin-17A(mIL-17A),construct mIL-17A prokaryotic expression plasmid and express bioactive mIL-17A protein inE.coil Rosetta(DE3)PlysS.Methods:The total RNA of the mouse thymus stimulated by human IL-1βwas abstracted,and then the RNA was reverse-transcripted into cDNA that was used as the template for PCR reaction.The primers were designed according to the published mIL-17A sequence.The cDNA coding for mature mIL-17A was cloned by nested PCR.The mIL-17A cDNA was subcloned to the prokaryotic expression vector pHisSUMO Express and confirmed by DNA sequencing.The pHisSUMO Express-mIL-17A was transformed into the ROSETTA competence cells.The recombinant bacteria were induced by IPTGfor protein expression,and the Western blot was used to confirm the protein.The purified protein was used to stimulate the pre-adipocyte 3T3-L1 cells.Expression of IL-6 was detected by real time PCR.Results:The mIL-17A was clonedfrom the mouse thymus stimulated by human IL-1β.The recombinant mIL-17A was expressedfrom prokaryotic system and purified as an inclusion body.The mIL-17A was confirmed by Western blot using conmmerially available antibody against mIL-17A.The purified mIL-17A upregulated the expression of IL-6 in pre-adipocytes 3T3-L1 cells.Conclusion:The mouse IL-17A is cloned from thymus and bioactive mIL-17A is purified for further study of the cytokine.

mIL-17;Cloning;Expression;Inclusion;Activity detection

Q78

A

1000-484X(2010)09-0783-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.09.004

①本文為哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金(2006RFXXS002)、東北農(nóng)業(yè)大學創(chuàng)新團隊項目(CXZ001)

張 薇(1986年-),女,在讀碩士,E-mail:zhangwei-baomashan@163.com;

及指導教師:李德山(1950年-),男,龍江學者,東北農(nóng)業(yè)大學特聘教授,主要從事治療Ⅱ型糖尿病新藥物的研究、治療類風濕性關(guān)節(jié)炎基因工程抗體的研究、發(fā)現(xiàn)人resistin受體的研究,E-mail:deshanli@163.com。