結(jié)核分支桿菌鏈霉素耐藥基因的雜交檢測

韓中波

鏈霉素(Sm)作為最主要的一線抗結(jié)核藥物之一,但由于單純化療和不規(guī)律化療,其耐藥情況日益嚴(yán)重,對其耐藥性的研究受到重視。[1]有報(bào)道認(rèn)為結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素的產(chǎn)生是由于其核糖體蛋白 S12編碼基因 rpsL和 16SrRNA的編碼基因 rrs的缺失和突變所導(dǎo)致[2]。本院采用采用 PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測了 55株肺結(jié)核患者痰標(biāo)本臨床分離株,并對 25例結(jié)核患者痰標(biāo)本直接進(jìn)行 rpsL基因、rrs基因突變檢測,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 23例敏感株和32例耐 SM或含耐SM的臨床分離株來自本所。25例耐 SM或含耐SM的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本來自本院住院結(jié)核患者。按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)為結(jié)核分支桿菌并對鏈霉素耐藥。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌 DNA的制備[3]臨床分離株 DNA用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取標(biāo)本中 DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用 25μl反應(yīng)體系,4XdNTPs終濃度為0.2mmol/L,Bio-標(biāo)記引物終濃度為 0.2μmol/L,擴(kuò)增程序?yàn)?94℃變性 Imin,58℃退火 1min,72℃延伸 Imin,循環(huán) 30次,最后 72℃延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測出現(xiàn) 267bp條帶。

1.2.3 雜交檢測 將點(diǎn)有探針的硝酸纖維素膜裝入雜交袋中,加入雜交液放置水浴鍋中進(jìn)行預(yù)雜交:45℃×30min。將Bio-標(biāo)記引物的 PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物變性:95℃×l0min,取出迅速放入冰盒中,每毫升雜交液一般加 l0μl變性的擴(kuò)增產(chǎn)物,放置水浴鍋中進(jìn)行雜交:45℃ ×30min。洗膜:洗液 1、45℃ × 3min,洗液 2、45℃×3min。 SA-AP:用 1∶1000的稀釋液(洗液Ⅰ)與膜在 37℃作用 30min。洗膜:洗液Ⅰ、45℃×3min,洗液Ⅱ、45℃×3min。顯色:每毫升洗液 I加入 NBT 6.6μl、BICP3.3μl混勻,將配好的顯色液加入雜交袋中,閉光 37℃顯色 5min,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增,以結(jié)核分支桿菌 H37RV為對照,23株藥物敏感株、32株耐 SM分離株 rpsL、rrs基因擴(kuò)增均為陽性;25例耐 SM肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中 rpsL基因 18例擴(kuò)增陽性、rrs基因 14例擴(kuò)增陽性(見表 1)。

2.2 應(yīng)用寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測 rpsL、rrs基因突變結(jié)果(見表 1、2)。

表1

表2 對 55例臨床分離株的檢測結(jié)果(%)

23株藥物敏感株的rpsL、rrs基因突變率分別為 4.3%、0。32株耐 SM分離株中,21株 rpsL基因發(fā)生突變,突變率為65.6%;4株 rrs基因發(fā)生突變,突變率為 12.5%。耐 SM肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中,基因突變檢測率分別為 50.0%、7.2%。

3 討論

迄今,檢測結(jié)核桿菌藥敏的傳統(tǒng)方法仍然是培養(yǎng)法,但由于結(jié)核桿菌生長緩慢,使藥敏測定結(jié)果需要兩個月,甚至更長時間,這也是影響結(jié)核病化療效果的原因之一。因此,建立一種新的快速,有效的藥敏試驗(yàn)方法對結(jié)核病的早期治療具有重要的意義。有研究表明[4]結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素的產(chǎn)生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和 16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導(dǎo)致。本實(shí)驗(yàn)室前期通過PCR-SSCP方法得出耐鏈霉素時,rpsL、rrs基因總突變率為 72.2%。[4]但PCR-SSCP方法建立在凝膠電泳基礎(chǔ)上,難于標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制,難以大規(guī)模推廣。通過對rpsL、rrs基因核心易變區(qū)進(jìn)行DNA序列分析。根據(jù)基因突變的中心區(qū)域,設(shè)計(jì)靶基因,制備寡核苷酸探針,點(diǎn)樣在雜交膜上,進(jìn)行PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交。

PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交檢測 rpsL、rrs基因突變,23株藥物敏感株的 rpsL、rrs基因突變率分別為 4.3%、0。32株耐 SM分離株中,21株 rpsL基因發(fā)生突變,突變率為65.6%;4株 rrs基因發(fā)生突變,突變率為 12.5%。由于有4.3%的敏感株也突變,說明某些耐藥菌株的形成可能與rpsL、rrs突變無關(guān)。

筆者用PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)直接檢測了 25例耐SM肺結(jié)核患者痰標(biāo)本,rpsL基因 18例擴(kuò)增陽性、rrs基因 18例擴(kuò)增陽性,其基因突變檢測率分別為 50.0%、7.2%。低于耐 SM臨床分離株。這可能是由于痰標(biāo)本雜質(zhì)多,同時痰標(biāo)本的處理和靶DNA濃度對 PCR擴(kuò)增有直接影響。PCR-寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)以其簡便、快速、靈敏并可以直接檢測未經(jīng)培養(yǎng)的痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌rpsL、rrs基因突變,為臨床檢測結(jié)核分支桿菌對鏈霉素耐藥性提供了初步依據(jù)。

[1] Marttuke GJ,Soini H,Vyhneueskiy B.Rapid detection of rifampinresistant.mycobacterium trberoulosis by Sequencing and line probe assay.Scand JInfect Dis,1998,30(2):129-132.

[2] Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mech anism ofmultiple drug resistance in clinical isolates of mycobacterium trberoulosis.JID,1995,171(4):954-957.

[3] SmallScale Mycobacterial hromosomalDNA extraction.MRC,1995.

[4] 張小剛,李書琳,等.結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素耐藥基因的檢測.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2001,17(10):1006-1007.