基于AOTF-近紅外光譜技術(shù)的復(fù)方丹參片快速無(wú)損質(zhì)量控制研究

武衛(wèi)紅， 王 寧*， 石俊英， 董海平

(1.山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，山東濟(jì)南250002;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355;3.濟(jì)南金宏利實(shí)業(yè)有限公司，山東濟(jì)南250100)

復(fù)方丹參片是防治心腦血管疾病常用中成藥之一，2005版《中國(guó)藥典》分別采用薄層層析法和HPLC法對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析，對(duì)控制復(fù)方丹參片的質(zhì)量發(fā)揮了積極的作用，但因檢測(cè)分析過(guò)程操作煩瑣，無(wú)法實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)無(wú)損快速分析，使得在線質(zhì)量控制及流通領(lǐng)域中假劣藥品的快速實(shí)驗(yàn)篩查難以進(jìn)行。另外，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自不同廠家的復(fù)方丹參片質(zhì)量和療效存在很大差異［1］，這不僅與指標(biāo)成分的含量差異有關(guān)，而且也和制劑中總成分的數(shù)和量有密切關(guān)系，有專(zhuān)家提出亟待完善現(xiàn)行藥典對(duì)復(fù)方丹參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的問(wèn)題［2］。因此，當(dāng)前迫切需要一種快速、高效、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的新型分析測(cè)試技術(shù)來(lái)完善復(fù)方丹參片的質(zhì)量檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高中成藥的檢測(cè)水平，加速中藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。

近紅外分析技術(shù)以其速度快、成本低、無(wú)損采樣的特點(diǎn)，近年來(lái)已成功應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域［3-4］?！奥暪饪烧{(diào)濾光器(AOTF)”-第五代近紅外光譜儀因其具有便攜、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、可用于現(xiàn)場(chǎng)快速分析等優(yōu)勢(shì)在分析測(cè)試領(lǐng)域中已備受青睞［5］。國(guó)內(nèi)，本研究團(tuán)隊(duì)率先將此技術(shù)引入藥物分析領(lǐng)域中，獲得較滿意的研究結(jié)果［6-7］。本研究將AOTF-近紅外光譜技術(shù)引入到復(fù)方丹參片的定性定量分析中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)方丹參片的無(wú)損快速定性檢測(cè)和對(duì)丹酚酸B、丹參酮ⅡA、水浸出物、醇浸出物4項(xiàng)指標(biāo)的同時(shí)、快速、無(wú)損定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國(guó)BRIMROSE公司生產(chǎn)的Luminar 5030-731型便攜式AOTF技術(shù)近紅外光譜儀(主要部件:光學(xué)部分、電學(xué)控制部分、筆記本電腦;儀器波長(zhǎng)范圍1 100 nm～2 300 nm，波長(zhǎng)增量2 nm，掃描次數(shù)300，采用InGaAs檢測(cè)器)。挪威CAMO公司The Unscrambler分析軟件。高效液相色譜儀(Anglient 1200、DAD 檢測(cè)器)。

1.2 試藥

復(fù)方丹參片 收集北京同仁堂制藥廠、安徽華佗國(guó)藥廠等56個(gè)廠家共215個(gè)批號(hào)，定性分析取166個(gè)批號(hào)為校正集，32個(gè)批號(hào)為驗(yàn)證集;定量分析取55個(gè)批號(hào)(來(lái)自5個(gè)大廠家)為樣本，其中5個(gè)批號(hào)為驗(yàn)證集。

中成藥對(duì)照品 咳喘寧、通宣理肺片、三黃片、金鳴片、雙黃消炎片、消渴靈片、消炎片、抗骨增生片、小兒消食片、丹參片均購(gòu)于濟(jì)南藥業(yè)集團(tuán)。

丹酚酸B對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111562-200504供含量測(cè)定用);丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110766-200417供含量測(cè)定用)。

1.3 化學(xué)方法測(cè)定樣本中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物含量

按2005版《中國(guó)藥典》［8］復(fù)方丹參片項(xiàng)下含量測(cè)定方法，采用HPLC法測(cè)定55個(gè)樣品中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量。儀器方法學(xué)考察結(jié)果，丹參酮ⅡA精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD分別為0.22%，0.22%，0.99%，平均回收率 96.7%，RSD為1.02%;丹酚酸B精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性RSD分別為2.58%，1.52%，1.25%，平均回收率96.6%，RSD為0.98%，均符合要求。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，相對(duì)偏差小于1.5%。

依照2005版《中國(guó)藥典》一部附錄XA中水浸出物、醇浸出物測(cè)定法，分別檢測(cè)55個(gè)樣本，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，相對(duì)偏差小于1.5%。

1.4 近紅外光譜采集

取不同批號(hào)樣品，將藥片分別置于出光孔位置，于1 100～2 300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行漫反射掃描，波長(zhǎng)增量2 nm，掃描平均次數(shù)為300次，每個(gè)批號(hào)樣品掃描10片，得到166個(gè)樣品的光譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方丹參片NIR吸收光譜圖Fig.1 Original NIR spectra of Compound Danshen Tablets

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理與模型構(gòu)建

對(duì)掃描得到的原始吸收光譜進(jìn)行微分處理，可以消除基線漂移的影響，可分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度。但導(dǎo)數(shù)光譜法放大了相鄰波長(zhǎng)點(diǎn)差異的同時(shí)也可能導(dǎo)致噪聲被放大，信噪比降低，經(jīng)比較本研究采取一階微分處理光譜數(shù)據(jù)。

原始光譜信號(hào)的平滑處理是消除噪聲的常用方法，可有效平滑高頻噪音，提高信噪比。本研究選擇平滑數(shù)為9，可達(dá)到理想效果。

主成分回歸分析法(PCA)是一種多元分析方法，被廣泛應(yīng)用在化學(xué)與測(cè)譜學(xué)分析中［9］，本研究利用該方法建立了片狀復(fù)方丹參片的定性分析模型，并對(duì)驗(yàn)證集和對(duì)照品進(jìn)行了驗(yàn)證。偏最小二乘法(PLS)，交叉-驗(yàn)證法(cross-validation)是 The Unscrambler定量分析軟件主要的數(shù)學(xué)處理方法，其特點(diǎn)為利用全部光譜信息，將高度相關(guān)的波長(zhǎng)點(diǎn)歸于一個(gè)獨(dú)立變量中，根據(jù)為數(shù)不多的獨(dú)立變量建立回歸方程，通過(guò)內(nèi)部交叉檢驗(yàn)防止過(guò)度擬合［10］。本研究采用該方法建立片狀復(fù)方丹參片中4個(gè)參數(shù)的定量分析模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

2.1.1 PCA定性模型

166個(gè)校正集復(fù)方丹參片樣品的PC1、PC2主成分空間分布圖見(jiàn)圖2，圖中無(wú)明顯異常點(diǎn)，說(shuō)明校正集樣本在一定區(qū)域內(nèi)呈較均勻的分布。

圖2 校正集復(fù)方丹參片樣品的PC1、PC2主成分空間分布圖Fig.2 Score diagram of PC1 to PC2 of calibration set

2.1.2 定性分析模型驗(yàn)證復(fù)方丹參片驗(yàn)證集樣品

調(diào)用定性模型，對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。軟件以?xún)煞N方法顯示結(jié)果，一是以表格顯示，二是模型區(qū)域判別顯示。左側(cè)表格中驗(yàn)證集樣品編號(hào)后均有*號(hào)標(biāo)記，說(shuō)明它們屬于模型內(nèi)樣品;模型區(qū)域圖中，驗(yàn)證集樣品均落在模型區(qū)域內(nèi)(圖中△號(hào)代表驗(yàn)證集樣品，●號(hào)表示模型區(qū)域)，說(shuō)明被檢測(cè)的樣品與建模樣品相同，被定性分析模型認(rèn)可。

兩種顯示方法均表明被檢測(cè)的樣品屬于建模樣品， 即是復(fù)方丹參片。

圖3 定性模型對(duì)驗(yàn)證集驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Result of performance of qualitative model with Compound Danshen Tablets

2.1.3 定性分析模型驗(yàn)證中成藥對(duì)照品

調(diào)用復(fù)方丹參片定性分析模型，驗(yàn)證中成藥對(duì)照品，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖中顯示，對(duì)照品編號(hào)后均無(wú)*號(hào)標(biāo)記，說(shuō)明10種中成藥均可被模型有效排除;模型區(qū)域圖中，對(duì)照品均沒(méi)有落在模型區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明被檢測(cè)樣品與建模樣品不相同，即不是復(fù)方丹參片。

圖4 定性模型對(duì)中成藥對(duì)照品的驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Result of performance of qualitative model with reference substance

以上結(jié)果表明，AOTF-近紅外光譜技術(shù)建立的復(fù)方丹參片片狀定性分析模型可對(duì)驗(yàn)證集、對(duì)照品進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別，因此，在實(shí)際工作中可直接對(duì)復(fù)方丹參片(薄膜衣)進(jìn)行快速定性分析，本研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)方丹參片樣品的無(wú)損直接定性鑒別，為生產(chǎn)中無(wú)損快速檢測(cè)和商品流通中的打假工作提供了一種新的分析方法。

2.2 定量分析

2.2.1 PLS1數(shù)學(xué)模型

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)與HPLC分析數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，用The Unscrambler定量分析軟件采用PLS法，交叉-驗(yàn)證法建立模型。NIR和HPLC測(cè)定的異常值分別采用光譜影響值Leverage和化學(xué)值誤差Residual兩個(gè)統(tǒng)計(jì)量來(lái)檢驗(yàn)剔除，并根據(jù)NIR數(shù)學(xué)模型的主要參數(shù)內(nèi)部交叉驗(yàn)證決定系數(shù)(R2CV)、內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)、外部驗(yàn)證決定系數(shù)(R2Cal)、外部驗(yàn)證均方差(RMSEP)確定最優(yōu)模型。復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物PLS1數(shù)學(xué)回歸模型參數(shù)見(jiàn)表1，表中參數(shù)顯示4個(gè)模型較為理想。

表1 PLS1數(shù)學(xué)回歸模型參數(shù)Tab.1 PLS1 regression model parameters

2.2.2 檢測(cè)模型效果

以PLS1建立的校正模型對(duì)5份外部驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，再對(duì)預(yù)測(cè)值與化學(xué)值進(jìn)行相關(guān)分析和顯著性t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。從預(yù)測(cè)值與化學(xué)值之間的相關(guān)性看，醇浸出物的r值最好(0.898)，水浸出物r值最差(0.657)，但t顯著性檢驗(yàn)表明丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物4個(gè)參數(shù)預(yù)測(cè)值與化學(xué)值之間差異并不顯著。

表2 PLS1回歸模型的驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Results of prediction for external validation set by PLS1 regression model

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取1個(gè)預(yù)測(cè)樣品，重復(fù)掃描20次，將所得光譜帶入建立的校正模型計(jì)算含量，以考察方法的精密度，結(jié)果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物的RSD值分別為3.62%，4.75%，2.22%，2.14%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1個(gè)預(yù)測(cè)樣品，每1 h掃描1次，于5 h內(nèi)重復(fù)掃描5次，考察樣品的穩(wěn)定性。丹參酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物的RSD值分別為1.73%，2.08%，3.32%，1.32%，，說(shuō)明樣品在5 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

以上結(jié)果表明，AOTF-NIR技術(shù)可以直接對(duì)復(fù)方丹參片進(jìn)行掃描，建立4個(gè)指標(biāo)的定量分析模型，不僅提高了效率，而且實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)方丹參片的無(wú)損定量分析。

3 結(jié)論

本研究在2005版《中國(guó)藥典》復(fù)方丹參片單純以指標(biāo)成分為標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)了對(duì)總成分的檢測(cè)，建立了復(fù)方丹參片中4個(gè)指標(biāo)的同時(shí)快速定量分析方法。該方法更加符合中醫(yī)藥特點(diǎn)，既客觀反映了中藥內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)，又在宏觀上有效控制了中藥整體質(zhì)量，使復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制更全面、更科學(xué)。

研究中采用Luminar 5030-731型便攜式聲光可調(diào)濾光器(AOTF)-近紅外(NIR)光譜儀，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)復(fù)方丹參片直接掃描獲取光譜信息，分別建立定性定量分析模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)方丹參片樣品的無(wú)損、直接快速分析，同時(shí)為其他中成藥的在線質(zhì)量控制和適時(shí)快速質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路。

［1］呂鳳蓮，宋韶錦，宋吉蓮，等.不同廠家復(fù)方丹參片的質(zhì)量考察［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，20(9):2230-2231.

［2］孫毅坤，周富榮，邸 峰.復(fù)方丹參片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究及其質(zhì)量考察［J］.中國(guó)藥事，2000，14(6):383-384.

［3］龔益飛，劉雪松，章順楠，等.近紅外光譜法在線判斷滴丸料液混合終點(diǎn)［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(7):509-511.

［4］Blanco M，Bano R G，Bertran E.Monitoring powder blending in pharmaceutical processes by use of near infrared spectroscopy［J］.Talanta，2002，56(1):203-212.

［5］Vikram K，Jean C G，Andrea B，et al.Online measurement of water content in candidate reference materials by acousto-optical tuneable filter near-infrared spectrometry(AOTF-NIR)using pork meat calibrants controlled by Karl Fischer titration ［J］.Food Chem，2008，106(4):1359-1365.

［6］王 寧，蔡紹松，李中文，等.一種基于聲光可調(diào)-近紅外光譜的雙黃連口服液快速定性分析方法［J］.中成藥，2008，30(5):688-692.

［7］武衛(wèi)紅，王 寧，蔡紹松，等.聲光可調(diào)-近紅外光譜技術(shù)用于丹參回流提取過(guò)程中丹參酮ⅡA含量的測(cè)定［J］.中藥材，2009，32(1):118-121.

［8］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:405.

［9］Wu Y Z，Chen Y，Ji JF，et al.Feasibility of Reflectance Spectroscopy for the Assessment of Soil Mercury Contamination［J］.Environ Sci Technol，2005，39(3):873-878.

［10］蔣煥煜，應(yīng)義斌.尖椒葉片葉綠素含量的近紅外檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27(3):499-502.