水溶性殼聚糖與牛血清白蛋白相互作用的研究

馮小強(qiáng),伏國(guó)慶,李小芳,楊 聲＊

1天水師范學(xué)院生化學(xué)院;2天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科,甘肅天水 741001

水溶性殼聚糖與牛血清白蛋白相互作用的研究

馮小強(qiáng)1,伏國(guó)慶2,李小芳1,楊 聲1＊

1天水師范學(xué)院生化學(xué)院;2天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科,甘肅天水 741001

采用紫外和熒光光譜研究了水溶性殼聚糖 (CS)與牛血清白蛋白 (BSA)之間的相互作用。結(jié)果表明:隨 CS濃度的增加,BSA的紫外吸收光譜表現(xiàn)出明顯的增色效應(yīng)和較小的紫移;CS可以猝滅 BSA的內(nèi)源熒光,其猝滅機(jī)理是 CS與BSA形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。并且測(cè)定了在不同溫度下,該反應(yīng)的結(jié)合常數(shù) KA分別為6.92×106(298 K),5.01×106(308 K),3.31×106(318 K),CS與 BSA以摩爾比 1∶1結(jié)合。同時(shí)采用同步熒光光譜法探討了 CS對(duì)BSA構(gòu)象的影響。

水溶性殼聚糖;牛血清白蛋白;紫外光譜;熒光光譜

殼聚糖(簡(jiǎn)稱CS)是甲殼素脫乙酰基后的產(chǎn)物,具有無毒、生物相溶、可降解、廣譜抑菌等特性,在醫(yī)學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、輕工業(yè)等領(lǐng)域有著極為廣泛的應(yīng)用[1]。血清白蛋白能和許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)結(jié)合,攜帶這些物質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、分配和代謝,在體內(nèi)起著酸度保持、金屬離子、氨基酸、脂肪酸、藥物等的貯存、運(yùn)載等重要的作用[2],是基礎(chǔ)科學(xué)研究中最常用的藥物靶蛋白之一[3,4]。有關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究,是目前生命科學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注和感興趣的課題[5],因此研究藥物與血清白蛋白的相互作用對(duì)闡明藥物的作用機(jī)制具有重要的理論意義。關(guān)于 CS與BSA的相互作用未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文在生理 pH條件下研究 CS與 BSA的相互作用,討論了 CS對(duì) BSA內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)制,經(jīng)過計(jì)算得到了 CS與 BSA之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

殼聚糖 (水溶性 60目濟(jì)南海德貝海洋生物工程有限公司);0.05 mo1/L的 Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4,含 0.1 mo1/L NaCl以維持溶液離子強(qiáng)度),并以此為溶劑配制 1.0×10-5mo1/L的牛血清白蛋白 (BSA,北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì) (日本島津); UV-2450紫外可見分光光度計(jì) (日本島津);Spectrum One傅立葉紅外光譜儀 (Perkin E lmer)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在 10 mL比色管中依次加入 2.0 mL Tris-HCl緩沖溶液,2.0 mL BSA溶液和一定量的 CS溶液,以Tris-HCl緩沖溶液定容為 10 mL,分別在 25、35、45℃下作用 30 min。設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為 3 nm,λex=280 nm,在 300～450 nm范圍內(nèi)測(cè)定的BSA及 CS作用下 BSA的熒光光譜;固定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)間隔Δ λ=60 nm,記錄同步熒光光譜;在 220～500 nm范圍內(nèi)測(cè)定其紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA與 CS相互作用的紫外光譜

動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài),并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜;在靜態(tài)猝滅中,由于猝滅劑與猝滅物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生相互作用,形成基態(tài)配合物,從而引起紫外吸收光譜的變化[6]。由圖 1可見,隨著 CS的加入,BSA在 280 nm處吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),峰位緩慢紫移,在 280 nm處吸收峰位紫移到277 nm,表明 CS與BSA混合后發(fā)生了相互作用,生成了一種復(fù)合物。BSA在 280 nm處的吸收峰是其肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)π-π＊躍遷引起的,吸收強(qiáng)度隨 CS濃度的增加而增強(qiáng),說明 CS配位誘導(dǎo)BSA分子發(fā)生類似降 pH值所出現(xiàn)的蛋白質(zhì)肽鏈伸展現(xiàn)象[7],使包圍在 BSA分子內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來,使吸收強(qiáng)度增強(qiáng),同時(shí)疏水基團(tuán)之間的疏水作用減弱,ππ＊躍遷能量增大,使吸收峰發(fā)生藍(lán)移。

2.2 BSA與 CS相互作用的紅外光譜

在 4000～600 cm-1區(qū)域測(cè)定了 CS、BSA和BSA/ CS配合物的 I R光譜。配合物與 BSA的 IR光譜相比較,某些吸收峰的振動(dòng)頻率和強(qiáng)度有明顯的區(qū)別。BSA中νN-H伸縮的 3413 cm-1帶,在配合物中變成寬峰;BSA中νC-H伸縮的 2929 cm-1帶,在配合物中發(fā)生巨大的變化。這表明BSA與 CS作用形成配合物時(shí),端基及殘基上的氮原子參與成鍵且有氫鍵締合作用。BSA酰胺Ⅰ帶的νCOO-的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的 1638 cm-1帶,在配合物中變成 1646 cm-1;酰胺Ⅱ帶的νCOO-的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的 1618 cm-1帶,在配合物中移至 1598 cm-1。由此可知,BSA羥基上的氧和酰胺帶Ⅰ的氮與 CS有直接的鍵合作用。

圖 1 CS對(duì)BSA的紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of CS on the absorption spectra ofBSA. CCS1～7∶0,0.125,0.25,0.375,0.5,0.625 and 0.75 mg/mL,respectively.

圖 2 CS、BSA和BSA/CS配合物的 I R光譜Fig.2 IR spectra of CS,BSA and BSA/CS.

2.3 熒光光譜

2.3.1 熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸 (Phe)等氨基酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源性熒光,而 CS不發(fā)熒光。在大多數(shù)情況下,蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻(xiàn),且含色氨酸殘基的天然熒光及變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身及其周圍環(huán)境的變化。當(dāng)某些小分子如藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合后,導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度下降,稱為熒光猝滅作用。

固定BSA溶液濃度不變,向其中加入不同濃度的 CS溶液,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在激發(fā)波長(zhǎng)為 280 nm時(shí), BSA的最大發(fā)射波長(zhǎng)為 339 nm;而殼聚糖在λem= 339 nm無熒光產(chǎn)生。隨著 CS濃度的增加,BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低,但發(fā)射峰位的位置和峰形變化不大(圖 3),這說明 CS對(duì) BSA的熒光有猝滅作用。且隨著 CS濃度的增加,熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)逐漸藍(lán)移,表明色氨酸疏水性增強(qiáng)。

圖3 CS對(duì)BSA的熒光猝滅圖Fig.3 The effect of CS on the fluorescence spectra ofBSA CCS1～7∶0,0.125,0.25,0.375,0.5,0.625 and 0.75 mg/mL,respectively.

2.3.2 熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅分為 3種:動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài),并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜;在靜態(tài)猝滅中,由于猝滅劑與猝滅物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生相互作用,形成基態(tài)配合物。動(dòng)態(tài)猝滅符合 Stern-Vo lmer方程:

其中 F0為未加猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度;F為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度;kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù);τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命;ksv為 Stern-Vo lmer猝滅常數(shù),是雙分子猝滅速率常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比率;CQ為猝滅劑的濃度,mol.l-1。

靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)光的締合物,從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低的過程.若 KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),由于生物大分子的熒光壽命τ0約為 10-8s,各類猝滅劑對(duì)生物大分子的 Kq最大值為 2.0×1010L·mol-1·s-1[8]。

對(duì)不同溫度下BSA相對(duì)熒光強(qiáng)度 F0/F對(duì)猝滅劑 CS的濃度作 Stern-Volmer曲線 (圖 4),發(fā)現(xiàn) BSA相對(duì)熒光強(qiáng)度 F0/F與 CS濃度呈良好的線性關(guān)系。直線斜率為 Stern-Volmer熒光猝滅常數(shù) ksv,結(jié)果列于表 1。由表 1結(jié)果可知,在不同溫度下,CS對(duì)BSA的猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散控制的速率常數(shù),可以初步判斷 CS對(duì)BSA的熒光猝滅可能是屬于生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

此外,動(dòng)態(tài)與靜態(tài)猝滅也可依據(jù)不同溫度下的猝滅常數(shù)得以區(qū)別。對(duì)動(dòng)態(tài)猝滅,溫度升高將有利于熒光體和熒光猝滅劑分子之間的有效碰撞,并可以促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移過程,Ksv隨溫度的升高而增大;若是靜態(tài)猝滅,溫度升高,產(chǎn)物的穩(wěn)定性降低,靜態(tài)猝滅常數(shù) Ks減小[9]。在該研究體系中,CS對(duì) BSA的熒光猝滅曲線斜率隨溫度的升高而降低,即猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小,這進(jìn)一步表明 CS對(duì)BSA的熒光猝滅作用不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅,而是生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[10]。

圖 4 不同溫度下 CS與BSA作用的 Stern-Vo lmer圖Fig.4 Stern-Volmer plots of the interaction of CS and BSA at different temperatures

表 1 不同溫度下 CS對(duì) BSA熒光猝滅的 Stern-Volmer方程與猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer equation s and quenching constants for BSA fluorescence quenchingwith chitosan at different temperatures

熒光能量轉(zhuǎn)移可分為輻射能量轉(zhuǎn)移和非輻射能量轉(zhuǎn)移。若發(fā)生輻射能量轉(zhuǎn)移,會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)的熒光光譜畸形。圖 4中BSA的熒光光譜都沒有畸變,因此BSA與 CS之間的能量轉(zhuǎn)移不應(yīng)為輻射能量轉(zhuǎn)移。同時(shí) CS的熒光被敏化 (圖 5),在 562 nm左右出現(xiàn)一個(gè)熒光發(fā)射峰。相應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨與 CS結(jié)合的BSA的量增加而增加,這說明BSA分子與 CS之間存在能量轉(zhuǎn)移,即 BSA與 CS有配位作用。非輻射能量轉(zhuǎn)移包括分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移和分子間能量轉(zhuǎn)移。若供能體與受能體結(jié)合生成了復(fù)合物,則兩者之間的能量轉(zhuǎn)移為分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移,否則為分子間能量轉(zhuǎn)移。由上述分析可知,BSA與 CS之間的能量轉(zhuǎn)移應(yīng)屬于分子內(nèi)的非輻射能量轉(zhuǎn)移。

圖 5 BSA溶液對(duì)CS熒光光譜的影響Fig.5 Emission spectra of CS in the presence and absence of BSA(CCS=0.5 mg/mL)

在 CS對(duì)BSA的熒光靜態(tài)猝滅過程中,假設(shè)生物大分子BSA有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),可與猝滅劑 CS結(jié)合常數(shù)為 kA,則BSA與 CS的配合反應(yīng)可表示為:

當(dāng) CS的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 BSA濃度時(shí),熒光體系的熒光強(qiáng)度和 CS的濃度滿足以下關(guān)系:

一定濃度的BSA溶液中加入不同濃度的 CS溶液,根據(jù)方程 (3),由圖 6 lg(F0– F)/F～lgC(CS)曲線擬合得到方程、平衡常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)列于表2?？梢钥闯?CS與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均等于 1,說明每一個(gè)BSA分子與一個(gè) CS分子結(jié)合形成配合物,其結(jié)合常數(shù)隨溫度升高而減小,這是因?yàn)楫?dāng)溫度升高,有利于BSA與 CS結(jié)合產(chǎn)物的解離,使得平衡常數(shù)減小。

2.4 同步熒光光譜

藥物分子與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,不但直接猝滅了氨基酸殘基的熒光,而且還與周圍鄰近的氨基酸殘基相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)型和構(gòu)象的改變。這種作用的結(jié)果可能阻斷氨基酸殘基之間能量轉(zhuǎn)移的途徑并影響氨酸殘基周圍的微環(huán)境,從而使蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度改變且使熒光峰發(fā)生位移。

BSA的空間結(jié)構(gòu)由 3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,每個(gè)結(jié)構(gòu)域由 2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu),幾乎所有疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部,構(gòu)成疏水腔[11]。對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜,Δ λ =60 nm時(shí)僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光[9]。因?yàn)榘被釟埢淖畲蟀l(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān),所以由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。在室溫下,固定 BSA濃度,逐漸增大 CS的濃度,記錄Δ λ=60 nm時(shí)的同步熒光光譜(圖 7)。發(fā)現(xiàn)隨 CS濃度的逐漸增大,色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)峰位置都略藍(lán)移且強(qiáng)度逐漸降低,表明 CS的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生變化,色氨酸殘基所處環(huán)境的親水性減小,導(dǎo)致 BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境增強(qiáng)[12]。這與吸收光譜和熒光發(fā)射光譜藍(lán)移相吻合。

圖 7 CS對(duì)BSA同步熒光光譜的影響Fig.7 Effects of CS concentrations on synchronous fluorescence spectra ofBSA

3 結(jié)論

采用吸收光譜和熒光光譜法研究了 CS與BSA相互作用,確定了 CS對(duì) BSA的猝滅過程為靜態(tài)猝滅機(jī)制。CS可能進(jìn)入BSA內(nèi)而與BSA的 Trp殘基間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移,形成弱的熒光體,阻礙BSA內(nèi)部 Tyr殘基與 Trp殘基間的能量轉(zhuǎn)移,猝滅了BSA的內(nèi)源熒光,導(dǎo)致BSA發(fā)生熒光猝滅。在不同溫度下CS與BSA的結(jié)合常數(shù) KA分別為 6.92×106(298 K),5.01×106(308 K),3.31×106(318 K), CS與BSA以摩爾比 1∶1結(jié)合。

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The Interaction of Chitosan with Bovine Serum Album in

FENG Xiao-qiang1,FU Guo-qing2,L IXiao-fang1,YANG Sheng1＊

1College of B iology and Chem istry,Tianshui Nor m al Univerity;2Tianshui Traditional ChineseM edical Hospital,Tianshui 741001,China

The interaction between chitosan(CS)and Bovine Serum Albumin(BSA)was studied via ultraviolet-visible absorption and fluorescence spectra.The results showed that the ultraviolet absorption intensity ofBSA increased as the concentration of CS increased.The fluorescence of BSA is quenched regularly by CS,which belonged to static fluorescence quenching.The binding constants(KA)were 6.92×106(298 K),5.01×106(308 K)and 3.31×106(318 K), respectively,and they reacted at a molar ratio of 1∶1.CS on the confor mation ofBSA was analyzed by synchronous fluorescence spectra.

water-solubility chitosan;bovine serum albumin;ultraviolet spectrum;fluorescence spectrum

O636.1

A

1001-6880(2010)05-0894-05

2009-09-04 接受日期:2009-12-08

甘肅天水師范學(xué)院物理無機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科基金資助

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:ysh@mail.tsnc.edu.cn