頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定貞芪扶正膠囊中有機溶劑殘留量*

李辰，邸多隆，蔣生祥

（1. 五邑大學(xué) 應(yīng)用物理與材料學(xué)院，廣東 江門 529020；2. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定貞芪扶正膠囊中有機溶劑殘留量*

李辰1，2，邸多隆2，蔣生祥2

（1. 五邑大學(xué) 應(yīng)用物理與材料學(xué)院，廣東 江門 529020；2. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法，利用FFAP毛細(xì)管氣相色譜柱和FID檢測器，通過優(yōu)化色譜條件，外標(biāo)法同時測定貞芪扶正膠囊中殘留有機溶劑的含量. 經(jīng)方法學(xué)評價，待測化合物線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，峰面積重復(fù)性的RSD值小于10.65%，回收率結(jié)果符合要求. 該方法操作簡便、準(zhǔn)確可靠，可為控制中藥貞芪扶正膠囊及其他中藥制劑中有機溶劑的殘留量提供參考.

貞芪扶正膠囊；頂空進樣法；毛細(xì)管氣相色譜；有機溶劑殘留量

藥物中的殘留溶劑是指在原料藥或賦形劑的生產(chǎn)、制劑制備過程中產(chǎn)生或使用，在工藝中不能完全除盡的有機揮發(fā)性化合物. 自20世紀(jì)90年代起，殘留有機溶劑的毒性或致癌作用就引起了國際醫(yī)藥界和管理部門的關(guān)注和重視. 貞芪扶正膠囊具有補氣養(yǎng)陰的功效，是配合手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療、促進人體正常功能恢復(fù)的常用藥之一，其主要成分為女貞子和黃芪. 貞芪扶正膠囊傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是將各味藥煎煮、濃縮、成型，為進一步提高臨床療效，現(xiàn)利用大孔吸附樹脂技術(shù)分離、富集其中的有效成分. 該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥提取分離中，但由于其應(yīng)用有可能引入對人體有害的殘留有機溶劑而引起了極大的關(guān)注. 因此，在應(yīng)用大孔吸附樹脂改進貞芪扶正膠囊生產(chǎn)工藝的同時，需要對其中的有機溶劑殘留物建立檢測方法并加以控制. 大孔吸附樹脂屬于苯乙烯骨架型，有可能殘留正己烷、甲基環(huán)己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯等有機溶劑[1-2]. 目前，中國藥典(ChP)2005版、美國藥典(USP)2004版和英國藥典(BP)2004版中，以溶液直接進樣法或頂空進樣法測定有機溶劑的殘留量[3]. 采用頂空氣相色譜法測定中藥中大孔樹脂有機溶劑殘留物，可以減少樣品本身對色譜系統(tǒng)的干擾和對毛細(xì)管色譜柱的污染，靈敏度高、檢測速度快，且樣品前處理過程無需使用有機溶劑進行萃取，對分析人員和環(huán)境危害小，可作為研究中藥大孔樹脂有機溶劑殘留檢查的首選方法[4-7]. 根據(jù)《中國藥典》[8]和ICH（人用藥品注冊技術(shù)規(guī)范國際協(xié)調(diào)會）藥品中有機溶劑殘留量測定的指導(dǎo)原則，以及國家藥品監(jiān)督局對藥品注冊管理的有關(guān)規(guī)定，有必要對改進工藝的貞芪扶正膠囊中有機溶劑殘留物建立檢測方法，對其殘留量加以控制. 本文采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法，同時測定貞芪扶正膠囊中11種殘留有機溶劑的含量.

1 儀器及試藥

Varian 3400氣相色譜儀及FID檢測器（美國Varian公司）；自制頂空進樣器（包括恒溫裝置、頂空瓶、密封硅橡膠墊、鋁墊等）；貞芪扶正膠囊由甘肅扶正藥業(yè)有限公司提供（批號分別為20040801、20040802、20040803）；正戊烷、正己烷、正庚烷、正十一烷、苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、乙酸丁酯、N,N二甲基甲酰胺（DMF）等試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及頂空條件

FFAP石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm i.d.，0.5 μm）；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min的速率升溫至150 ℃；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度260 ℃；進樣量1 mL；分流進樣，分流比為1:10.

頂空條件：樣品量1 g，頂空瓶8 mL，樣品溶液1.30 mL，平衡溫度80 ℃，平衡時間30 min.

2.2 樣品測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取正戊烷、正己烷、正庚烷、正十一烷、苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、乙酸丁酯各適量，置于100 mL容量瓶中，以DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液（各組分濃度均約為10 mg/mL）. 精密量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，置5 mL容量瓶中，依次用DMF稀釋并定容至各組分濃度分別約為1 000.0、500.0、200.0、100.0、40.00、20.00、10.00、4.000 mg/L，即得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液I~VIII.2.2.2 受檢溶液制備

取貞芪扶正膠囊裝量差異項下的內(nèi)容物，研細(xì)，用分析天平稱取1.000 0g，置8 mL頂空瓶中，加入1.30 mL DMF，立即加蓋密封、搖勻，即得.

2.2.3 樣品測定

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液、受檢溶液各1.30 mL，分別置于8 mL頂空瓶中，加入攪拌磁子，立即封口后于80 ℃油浴中攪拌30 min后，抽取頂空瓶上方氣體1 mL，插入氣化室分析（進樣針預(yù)先于70 ℃保溫），按照2.1項色譜條件及頂空條件進樣分析，外標(biāo)法計算受檢中11種有機溶劑的殘留量.

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗

取標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣分析，理論板數(shù)按正戊烷、正己烷、正庚烷、苯、甲苯、乙酸丁酯、正十一烷、乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯計，分別為 9 073，7 368，8 229，2 464，2 663，10 009，13 649，30 394，32 268，18 365，57 056；2個相鄰色譜峰的峰分離度依次分別為：3.64，6.70，46.90，32.07，10.70，6.50，13.73，2.67，17.25，23.39，標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜圖見圖1.

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢測限

取系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進樣分析，每個濃度樣品重復(fù)進樣3次，以待測組分峰面積平均值（μV?s）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ mg ?L-1）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢測限見表1.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

表1 線性方程相關(guān)系數(shù)與線性范圍（n=3）

2.3.3 精密度實驗

取標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)頂空分析5次，計算保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），11種化合物保留時間、峰面積的RSD分別為0.13%~0.85%和5.23%~10.65%之間.

2.3.4 方法重現(xiàn)性

取貞芪扶正膠囊裝量差異項下的內(nèi)容物（批號20040803）5份，測出樣品中含有正戊烷、正己烷、正庚烷及乙酸丁酯，保留時間的RSD分別為0.73%，0.76%，0.66%，0.26%；峰面積的RSD分別為8.66%，10.72%，7.53%，6.89%.

2.3.5 回收率實驗

取6份貞芪扶正膠囊裝量差異項下的內(nèi)容物，研細(xì)，每份約1 g，精密稱定，其中3份各加入標(biāo)準(zhǔn)混合溶液III 1.30 mL，另外3份各加入標(biāo)準(zhǔn)混合溶液V 1.30 mL，置8 mL頂空瓶中，加蓋密封，按2.2.3項方法進行分析并計算其回收率，結(jié)果見表2.

表2 回收率實驗結(jié)果（n=3）

2.4 樣品測定結(jié)果

精密稱取3批貞芪扶正膠囊樣品，按2.2項方法進行分析，各批次樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果見表3，樣品色譜圖見圖2. 按色譜圖出峰時間對待測樣品組分進行定性測定，按各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量計算. 受檢樣品中檢出含有正戊烷、正己烷、正庚烷和乙酸丁酯，其余7種殘留溶劑均未檢出.

表3 樣品測定結(jié)果(n=3)

3 討論

圖2 受檢溶液色譜圖

3.1 色譜條件選擇

由于本實驗所要檢測的有機溶劑組分較多，選擇 SE-54弱極性毛細(xì)管色譜柱來測定有機溶劑殘留量時，各組分分離不完全且DMF出峰快，對測定有干擾；而選用FFAP極性毛細(xì)管色譜柱，各組分均可達(dá)到良好的分離和較高的柱效，且極性溶劑DMF在被分析組分后出峰，避免了對待測組分的干擾. 起始柱溫50 ℃較低且恒溫5 min，有利于低沸點的烷烴和苯系物的彼此分離，然后以5 ℃/min升至150 ℃，使沸點較高的其他組分和高沸點的溶劑DMF分離度好，在22 min全部出峰.

3.2 頂空條件優(yōu)化

經(jīng)實驗確定頂空瓶不抽真空密封性更好，待測組分峰面積響應(yīng)值大. 進樣時，雖頂空瓶中的少量空氣可進入色譜柱，但由于柱溫低又有分流放空，少量空氣很快就會隨載氣放空或流出色譜柱，不會對色譜柱有什么影響，且在選定條件下并沒有使待測組分發(fā)生氧化、分解和其他改變，不干擾分離和測定，故選擇不抽真空直接密封頂空瓶. 通過考察平衡溫度對測定的影響，實驗發(fā)現(xiàn)所有組分的峰面積基本都有按溫度升高逐漸增大的趨勢（50 ℃除外），且平衡溫度對高沸點組分的影響較低沸點的小，當(dāng)平衡溫度超過80 ℃時變化趨于平緩，故選擇80 ℃為平衡溫度. 通過考察平衡時間對測定的影響，實驗發(fā)現(xiàn)低沸點組分平衡攪拌20 min、高沸點組分平衡攪拌30 min峰面積值最大，考慮到高沸點組分的測定靈敏度，選擇平衡時間為30 min.

3.3 藥品中有機溶劑殘留量的限度

根據(jù)《中國藥典（2005年版）》二部附錄VIII P中“有機溶劑殘留量測定的要求”及《中國藥典檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范 2005年版》P210頁“殘留溶劑測定法”項下有關(guān)“藥品中常見的殘留溶劑及限度”的有關(guān)規(guī)定：藥品含殘留溶劑苯、甲苯不得超過2 μg/g，含乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、正戊烷、正己烷、正庚烷、正十一烷不得超過20 μg/g. 故本文測定的貞芪扶正膠囊樣品有機溶劑殘留量符合濃度限度規(guī)定.

本實驗的 11種有機溶劑用相應(yīng)的分析純化合物替代，經(jīng)氣相色譜 FID檢測器檢驗，試劑純度均大于98%，可滿足定性定量要求.

[1]袁海龍，李仙義，肖小河，等. D-101型大孔樹脂殘留物的頂空進樣法分析研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2003, 14(2): 121-122.

[2]鐘淮濱，孫凌云，童成亮. 頂空氣相色譜法檢測腦安泰中樹脂殘留物[J]. 安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006, 25(5): 46-47.

[3]陳蘇偉，潘勇琴，蔡紀(jì)青. 中、美、英三國藥典中有機溶劑殘留量測定法的比較[J]. 海峽藥學(xué)，2006, 18(5): 83-84.

[4]唐慶華. 柴胡軟膠囊有機溶劑殘留的頂空氣相色譜法測定[J]. 生命科學(xué)儀器，2006, 4(2): 43-44.

[5]汪 杰，劉元瑞，劉祖德. 頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定注射用氨芐西林鈉中的有機溶劑殘留量[J]. 中國藥學(xué)雜志，2004, 39(8): 626-628.

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[8]中華人民共和國藥典委員會. 中國藥典[M]. 2005版. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[責(zé)任編輯：熊玉濤]

Determination of Residual Organic Solvents in Zhenqi Fuzheng Capsules by Using Headspace Capillary Gas Chromatography

LI Chen1,2, DI Duo-long2, JIANG Sheng-xiang2
(1.School of Applied Physics & Materials Engineering, Wuyi University, Jiangmen 529020, China; 2. Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

The content of residual organic solvents in Zhenqi Fuzheng capsules is determined by using the headspace capillary gas chromatography method involving the FFAP capillary column and the FID detector, and by optimizing the chromatographic conditions and adopting the external standard method. The linear correlation coefficients are all more than 0.99, the RSD of reproducibility of the components is all less than 10.65% and the recovery rates accord with the requirements. The method is simple, accurate and reliable and can be used for controlling the residual organic solvents in Zhenqi Fuzheng capsules and other traditional Chinese medicines.

Zhenqi Fuzheng capsules; headspace sampling; capillary gas chromatography; residual organic solvent

O657.7；R914.4

A

1006-7302（2010）02-0006-13

2010-01-10

李辰（1976—），男，甘肅蘭州人，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物分離分析及質(zhì)控方法研究，E-mail: simmonlee@163.com.

*注：本文工作在中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所完成，部分內(nèi)容曾在2007年12月召開的第9屆全國中藥和天然藥物學(xué)術(shù)研討會上討論并公布.