尚曉婭,欽傳光,曹 剛,徐春蘭,牛衛(wèi)寧
西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,西安 710072
絞股藍多糖提取分離、化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性的研究進展
尚曉婭,欽傳光*,曹 剛,徐春蘭,牛衛(wèi)寧
西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院,西安 710072
絞股藍是我國特色天然資源,近年來研究發(fā)現(xiàn)多糖是其重要的藥用活性成分,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、抗疲勞等生物活性。更重要的是絞股藍多糖不僅具有顯著的抗腫瘤活性,還參與和介導(dǎo)了免疫功能的調(diào)節(jié),能夠提高機體免疫功能而對正常細胞沒有毒副作用,在惡性腫瘤、艾滋病等威脅人類健康疾病的防治和治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景,有希望開發(fā)成我國特色的創(chuàng)新藥物。本文對絞股藍多糖分離純化、結(jié)構(gòu)以及生物活性等方面進行詳細綜述,為以后進一步研究提供理論參考。
絞股藍多糖;分離純化;結(jié)構(gòu);生物活性
絞股藍 (Gynostemm a pentaphyllumMakino)為葫蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物,具有增強免疫、抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化等作用,且安全無毒[1-3]。1986年,國家科委在“星火計劃”中,把絞股藍列為待開發(fā)的“名貴中藥材”首位。2002年 3月 5日,國家衛(wèi)生部將其正式列為新資源藥食同源保健品。目前,全世界已知絞股藍植物有 13種,我國占 11種,其中 7種為我國獨有,占全部種數(shù)的53.8%。絞股藍主要分布在亞洲一些國家,在我國應(yīng)屬陜西絞股藍資源最為豐富,主要分布在以秦巴山區(qū)為中心的 37個縣市,安康、平利等縣市目前已成為我國絞股藍最大的生產(chǎn)基地,所產(chǎn)絞股藍品種最為優(yōu)良。近年研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖是絞股藍的有效活性成分之一,具有增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抗疲勞、保護肝損傷、保護神經(jīng)細胞谷氨酸氧化性損傷等生物活性。本文就絞股藍多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)、生物活性以及現(xiàn)階段的開發(fā)利用及研究展望等幾個方面進行詳細闡述,旨在為絞股藍多糖的深入研究和開發(fā)利用提供參考。
1.1 絞股藍多糖的提取
目前絞股藍多糖的提取方法主要為水提取和堿提取,后來又有研究者嘗試了微波輔助提取工藝,具體工藝提取條件見表 1。目前大多采用熱水提取法提取絞股藍多糖,熱水浸提的溫度一般為 80~100℃,浸提時間一般 1~2 h,浸提次數(shù) 1~3次。將浸提得到的多糖溶液過濾,濾液濃縮至一定體積后,利用多糖溶于水而不溶于醇的特點,將多糖用乙醇沉淀出來,沉淀分別用 95%乙醇、丙酮、乙醚洗滌,干燥得粗多糖。確定提取條件時,一般采用單因素法通過正交實驗設(shè)計對提取工藝條件進行優(yōu)化。
此外,微波輔助提取絞股藍多糖也是一種行之有效的提取方法。池愛平等[8]在此工藝條件下,多糖提取率為 3.37%。較熱水浸提法相比,絞股藍水溶性多糖提取率增加 0.55%。可見微波輔助提取能縮短提取時間,提高絞股藍多糖提取率。與熱水浸提法相比較,微波輔助提取技術(shù)的最大優(yōu)點是提高提取率、節(jié)省時間,同時它還具有成本低、投資少的優(yōu)點,在工業(yè)化提取植物有效成分方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
表 1 絞股藍多糖工藝提取條件Table 1 Extraction of polysaccharides fromGynostemm a pentaphyllumMakino
1.2 絞股藍多糖的分離純化
目前比較詳細的絞股藍多糖分離純化工藝有兩種[9,10]:
絞股藍→95%乙醇回流 (50℃,6 h)→蒸餾水提取 (95℃,1.5 h)→過濾、濃縮、透析→4倍乙醇沉淀→洗滌沉淀,減壓干燥→粗多糖→8%水溶液→DEAE-Sepharose CL-6B柱層析→Sephadex G-100柱層析→均一的 3個多糖組分。
粗多糖→無水 CaCl2除果膠→H2O2脫色→3倍乙醇沉淀→洗滌沉淀,干燥→精制絞股藍多糖→0.5%水溶液→0.45μm濾膜過濾→Q Sepharose Fast Flow柱層析→Sephadex G-200柱層析→Sephadex G-25柱脫鹽→冷凍干燥→均一多糖 GPS-2和GPS-3。
絞股藍多糖除了用凝膠過濾色譜 Sephades G-200、Sephadex G-100等柱純化外,也用醋酸纖維素膜電泳(硼酸氫鈉緩沖液,pH 10)鑒定其純度,用甲苯胺藍在 40 v檢測 50 min。
水提醇沉獲得的多糖常含有較多的游離蛋白和植物色素,為了使多糖精品具有較好的色澤和較高的給藥安全性,應(yīng)經(jīng)過脫色和去蛋白的步驟對多糖進行精制。目前對絞股藍多糖的研究普遍沒有建立較完善的分離純化路線,難以得到均一的多糖組分。我們實驗室在經(jīng)過一系列的探討研究后,建立了適合秦巴絞股藍多糖分離純化的工藝路線,采用木瓜蛋白酶 +Sevag法除蛋白,并采用 H2O2法進行脫色,在本工藝路線中,我們在加入 Sevag試劑之前先進行脫色處理,得到了很好的效果。
關(guān)于絞股藍多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)目前研究較多的是單糖組成,但是結(jié)果各異,可能與產(chǎn)品的品種、研究手段等因素有關(guān)。Wang等[9]對絞股藍粗多糖(G M)進行分離純化后得到三個多糖組分:G MA、G MB、G MC,用 GC分析其單糖組成;宋淑亮等[10]從絞股藍中分離純化得到兩個均一多糖 GPS-2和GPS-3,對 GPS-3的單糖組成進行了分析;Yang等[11,12]分別用 HPLC和毛細管區(qū)帶電泳分析絞股藍多糖的單糖組成,其結(jié)果見表 2。
結(jié)構(gòu)方面目前僅有 Chi等[13]初步分析了絞股藍多糖抗疲勞活性主要組分 GPP1-a的一級結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)分析表明 GPP1-a是一種由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖 (1:0.72:0.18)組成的雜多糖,由 (1→4)連接的α-D-葡萄糖殘基構(gòu)成主鏈,分支位于O-6位置上,支鏈主要是(1→6)連接的α-D-葡萄糖、(1→3)連接的β-D-半乳糖和 (1→6)連接的α-D半乳糖殘基,末端為β-D-半乳糖殘基和β-L-阿拉伯糖殘基,其結(jié)構(gòu)見圖 1。
表 2 絞股藍多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides fromGynostemm a pentaphyllumMakino
圖 1 GPP1-a的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Gpp1-a
由上述研究可以推導(dǎo)絞股藍多糖的主要單糖組成可能為葡萄糖和半乳糖,可能還含有阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等單糖成分,其多糖主鏈可能主要由葡萄糖殘基構(gòu)成。從文獻報道可以看出,目前對絞股藍多糖結(jié)構(gòu)的研究報道較少,仍處于起步階段,其確切的化學(xué)結(jié)構(gòu)還需要大量深入的研究和分析。
3.1 免疫調(diào)節(jié)
免疫調(diào)節(jié)是植物多糖最重要和最主要的生物活性,研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖具有細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫功能。唐曉玲等[14]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖能顯著地增強環(huán)磷酞胺處理小鼠淋巴細胞的轉(zhuǎn)化增殖,說明絞股藍多糖對免疫受抑小鼠的細胞免疫功能具有顯著的促進作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖能顯著增強肝癌 Heps小鼠NK細胞活性,同時對淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力有所提高,說明其具有細胞免疫促進作用;絞股藍多糖能夠提高小鼠血清溶血素含量,說明其具有體液免疫促進作用;此外,絞股藍多糖還可以明顯提高小鼠碳粒廓清速率和 S180小鼠脾指數(shù),說明絞股藍多糖能夠提高非特異性免疫功能[15]。
劇烈運動會降低機體免疫能力,表現(xiàn)在免疫細胞數(shù)量減少,淋巴細胞轉(zhuǎn)換能力降低,細胞免疫功能降低;延遲性過敏反應(yīng)降低;主要免疫球蛋白 IgA、IgG以及重要補體 C3和 C4含量顯著降低;NK細胞的毒性降低,絲裂原誘發(fā)的淋巴細胞增殖作用 (衡量 T細胞功能)降低。研究發(fā)現(xiàn)服用絞股藍多糖對疲勞運動小鼠的免疫器官脾臟功能有增強作用,對小鼠特異性免疫能力有提高作用,高劑量下對于ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力有提高作用[16]。因此絞股藍多糖還能夠有效促進疲勞運動小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。
最近的一項研究表明絞股藍多糖是一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑,可以顯著促進腹膜巨噬細胞產(chǎn)生 NO, ROS和 TNF-α,并呈劑量依賴性。同時發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖抑制人結(jié)腸癌 HT-29和 S W-1116腫瘤細胞增殖,對其沒有直接的細胞毒性,由此推導(dǎo)絞股藍多糖抗腫瘤作用機理之一是通過增強機體的免疫功能,誘導(dǎo)細胞因子的表達,達到抗腫瘤的目的[12]。根據(jù)以上研究可以推導(dǎo)絞股藍多糖有可能與其它中藥多糖一樣,主要通過增強機體的免疫功能來達到殺傷腫瘤細胞的目的,即抗癌作用經(jīng)過宿主中介作用,增強機體的非特異性和特異性免疫,而非直接殺傷腫瘤細胞。
3.2 抗腫瘤
大量研究發(fā)現(xiàn)多糖抗腫瘤作用體現(xiàn)在兩個方面,一是對腫瘤細胞的直接抑制;二是提高宿主免疫功能,發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。最早研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)口服絞股藍粗多糖,荷瘤小鼠平均存活時間較對照組長,生命延長率高于 50%,初步表明絞股藍多糖具有較明顯的抗癌活性[17]。后來又有研究者對絞股藍多糖的抗腫瘤活性進行分析,發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖不僅對腫瘤細胞有顯著的抑制作用,而且對機體的免疫機能有一定的增強作用。
用絞股藍多糖 (GPS)對荷瘤小鼠灌胃后,測得對 S180肉瘤的抑制率為 31%;GPS用于體外培養(yǎng)的人食管癌細胞 ECa-109,抑制率高達 100%[18]??梢娊g股藍多糖對腫瘤細胞有較強的抑制和殺傷作用,可以直接抑制腫瘤細胞的生長。
絞股藍多糖對小白鼠移植性腫瘤 S180有顯著的抑制作用,與化療藥物 5-Fu合并使用能減輕化療藥物引起的骨髓抑制等不良反應(yīng),保護細胞免受自由基的攻擊,對機體的免疫機能有一定的增強作用[19]??梢娊g股藍多糖不僅具有顯著的抗腫瘤作用,而且能提高荷瘤鼠機體的免疫機能。
綜合前面免疫調(diào)節(jié)活性和上述抗腫瘤活性方面的研究結(jié)果,可以看出絞股藍多糖究竟是如何發(fā)揮抗腫瘤作用的?是直接殺傷腫瘤細胞,還是通過增強機體的免疫功能達到殺傷腫瘤細胞的目的?目前此問題仍不清楚,有待進一步探討和研究。
3.3 抗氧化
研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖是一種潛在的抗氧化劑,不同的組分之間抗氧化活性存在差異。Wang等[9]研究了絞股藍粗多糖 (G M)以及其三個均一組分G MA、G MB、G MC的抗氧化活性,并與Vc進行比較,結(jié)果表明 G M、G MB和 G MC比Vc具有更強的清除超氧自由基的能力,清除率分別為 93.3%、49.5%和57.9%;G M、G MA、G MB和 G MC均具有很強的清除羥自由基的能力,其中 G M、G MA和 G MB清除率分別為 57.0%、43.8Z%和 25.6%,比 Vc(20%)要高;G MA和 G MB對鄰苯三酚自氧化沒有抑制作用, G MC的抑制作用比 G M要顯著。可見組分 G MC在清除超氧自由基、羥自由基和鄰苯三酚方面均具有很強的抑制能力,是一種潛在的抗氧化劑。
婁振嶺等[20]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖底劑量組能降低正常小鼠脂質(zhì)過氧化 (LPO)水平,提高正常小鼠超氧化物歧化酶 (SOD)活性;高劑量組能顯著降低亞急性衰老模型小鼠脂質(zhì)過氧化水平,顯著提高亞急性衰老模型小鼠超氧化物歧化酶活性。可見絞股藍多糖的抗氧化活性呈劑量依賴性。
3.4 降血糖
淀粉酶抑制劑可抑制消化道,尤其是十二指腸的淀粉酶活性,因而減少或延緩消化道淀粉水解為單糖,使單糖的吸收減少而降低血糖,所以對糖尿病病人餐后高血糖以及過食碳水化合物引起的脂肪增加有對抗作用。研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖 (GP)在體外對α-淀粉酶具有較強的抑制作用,且呈劑量依賴性,其抑制率相當(dāng)于同等濃度阿卡波糖抑制作用的50%左右。同時通過研究 GP對四氧嘧啶高血糖大鼠降血糖作用,發(fā)現(xiàn) GP可降低四氧嘧啶大鼠的血糖及改善糖耐量,而不會導(dǎo)致低血糖,表明絞股藍多糖具有穩(wěn)定的降血糖活性。其降血糖機制可能與其刺激胰島素的釋放或促使急性胰島炎恢復(fù),抑制α-淀粉酶,延緩碳水化合物在小腸的吸收有關(guān)[21]。
3.5 抗疲勞
運動時自由基產(chǎn)生增多,被認為是引起運動性疲勞的重要原因之一。通過測定組織中MDA的濃度可以反映機體自由基生成的情況,而通過測定SOD、GSH-Px、CAT的活性可反映機體內(nèi)自由基清除的情況。疲勞運動小鼠補充絞股藍多糖后運動能力提高,其原因可能是因為絞股藍多糖能明顯提高小鼠的組織抗氧化能力,能有效地清除運動過程中產(chǎn)生的自由基,防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng),保護組織細胞膜的完整性,從而保證運動過程中的氧化供能[22]。
Chi等[13]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍均一多糖組分 GPP1-a能夠延長小鼠力竭運動的時間,可能是因為 GPP1-a可以清除力竭運動中產(chǎn)生的活性氧族 (ROS)。另外,研究發(fā)現(xiàn) GPP1-a可以顯著增加骨骼肌和肝臟中糖原的水平,誘導(dǎo) GPP1-a增加力竭運動時間,因為骨骼肌和肝臟中糖原的水平可以增強實驗動物的運動能力。然而 GPP1-a提高糖原水平的機理仍需要深入研究。
3.6 抗肝損傷
酒精性肝損傷是典型的肝損傷模型,酒精在進入機體之后,在乙醇脫氫酶催化下,可被脫氫氧化為乙醛和乙酸鹽,使三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱,從而影響脂肪代謝;同時酒精還能導(dǎo)致細胞基因組DNA斷裂,抑制DNA修復(fù)酶的功能,引發(fā)細胞凋亡等作用。宋淑亮等[23]通過研究絞股藍多糖對HepG2細胞酒精性損傷的保護作用,發(fā)現(xiàn)不同濃度的絞股藍多糖均可以提高損傷后 HepG2細胞的存活率,抑制 AST、ALT水平的升高,減少MDA的形成,提高 SOD的活性,減少細胞凋亡。
CCl4可以誘導(dǎo) HepG2細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡,研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖(PGP)對 CCl4導(dǎo)致的肝細胞損傷具有顯著的保護作用。MTT檢測顯示 PGP保護組細胞活性明顯高于損傷組;流式細胞儀測定細胞調(diào)亡率顯示 PGP保護組 (終濃度為 100μg/ mL)凋亡率明顯低于 CCl4損傷組,細胞周期各期細胞分布比例無明顯變化[24]。
除此之外,絞股藍多糖對 CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有明顯保護作用,絞股藍多糖各劑量組能明顯抑制肝損傷小鼠ALT、AST活性的升高;抑制肝組織中MDA含量的升高,提高肝組織中 GSH活性;減輕 CCl4對肝臟細胞的病理損傷[25]??赡苁且驗榻g股藍多糖具有抗脂質(zhì)過氧化作用,能直接捕捉、清除自由基,減輕自由基對脂膜及線粒體膜的攻擊,穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu),從而起到保護肝臟的作用,其具體的作用機制還有待進一步研究。
3.7 抗神經(jīng)細胞損傷
谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最高的一種神經(jīng)遞質(zhì),急性細胞損傷,如缺糖缺氧、創(chuàng)傷、缺血、昏厥等,會造成谷氨酸的大量釋放,從而對神經(jīng)元造成損傷。在許多神經(jīng)元退行性疾病中,如帕金森病、阿爾茨海默病和肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化等,谷氨酸也發(fā)揮著極其重要的作用。研究者在細胞水平研究絞股藍多糖對神經(jīng)細胞谷氨酸氧化性損傷的保護作用,發(fā)現(xiàn)不同濃度絞股藍多糖試驗組神經(jīng)細胞損傷有不同程度的減輕,與谷氨酸損傷組相比有顯著性差異,表明絞股藍多糖對神經(jīng)細胞谷氨酸氧化性損傷有明顯的保護作用。因此絞股藍多糖可以潛在地用于神經(jīng)退行性疾病方面的治療,但是目前其神經(jīng)細胞損傷保護作用的機制尚不明確,有待進一步研究[26]。
絞股藍是我國的特色資源,多糖是絞股藍的重要藥理活性成分,但是目前國內(nèi)外對絞股藍多糖的研究起步較晚,在多糖的提取、制備,分離純化,活性成份的篩選,結(jié)構(gòu)研究以及藥理作用機理等方面的研究水平遠遠落后于其它植物多糖。目前國內(nèi)外對絞股藍多糖的研究還存在以下有待深入研究的重要問題:
(1)目前對絞股藍多糖的研究大都停留在粗多糖的階段,較少得到均一的多糖組分,進一步進行生物活性方面研究時缺乏說服力。
(2)目前的研究主要集中在生物活性方面,但是此方面的研究不系統(tǒng),缺乏深度,其作用機理尚不清楚。
(3)除此之外,絞股藍多糖的均一組分和化學(xué)結(jié)構(gòu)尚不明確,目前尚未闡明絞股藍多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系,限制了絞股藍多糖藥物的研究和開發(fā)。
就目前的研究工作來講,絞股藍多糖方面的研究主要集中在國內(nèi),國外在此方面的研究尚未見文獻報道,可能主要因為資源所限?,F(xiàn)已研究報道絞股藍多糖的藥理作用主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抗疲勞、抗肝損傷這六個方面,特別是免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用比較明顯,值得深入研究,有望開發(fā)成新的抗腫瘤藥物和免疫調(diào)節(jié)劑。國內(nèi)對絞股藍多糖的研究處于優(yōu)勢,我們應(yīng)該充分利用我們的資源優(yōu)勢,研制具有我國特色的創(chuàng)新藥物。
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Advances in Research on the Polysaccharide from Gynostemm a pentaphyllumMakino
SHANG Xiao-ya,Q IN Chuan-guang*,CAO Gang,XU Chun-lan,N IU Wei-ning
Faculty of L ife Science,Northwestern Polytechnical University,Xi’an 710072,China
Gynostemm a pentaphyllumMakino is the natural resource with Chinese characteristics.The polysaccharide is one of the importantmedicine ingredientsofGynostemm a pentaphyllumMakino,which has the phar macological actions as the anti-tumor,immunomodulatory,antioxidation,anti-fatigue activity,decrease of blood glucose,and so on.Especially,Gynostemm a pentaphyllumMakino polysaccharide has not only the significant anti-tumor activity,but also joins in adjusting immune function,which can improve the immune function of organism but has no toxic side effect on normal cells. It hopes to be the original new drugwith Chinese characteristics.Therefore,its application haswide prospect.This article summarizes detailedly research developments on its separation,and purification,identification,structural analysis,biological activities and research progress.
polysaccharide fromGynostemm a pentaphyllumMakino;isolation and purification;structure;bioactivity
Q946.91;R284;O629
A
1001-6880(2010)03-0514-06
2009-04-07 接受日期:2009-06-16
國家自然科學(xué)基金 (NSFC 20802057);中國博士后科學(xué)基金 (20080441194)
*通訊作者 Tel:86-29-88491840;E-mail:loya721521@126.com