雙孢蘑菇多酚氧化酶交聯(lián)作用對(duì)酪蛋白乳化性及其穩(wěn)定性的影響

吳進(jìn)菊，高金燕，劉 瀟，程 偉，陳紅兵,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

雙孢蘑菇多酚氧化酶交聯(lián)作用對(duì)酪蛋白乳化性及其穩(wěn)定性的影響

吳進(jìn)菊1,2，高金燕1,3，劉 瀟1,2，程 偉1,2，陳紅兵1,2,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

利用雙孢蘑菇多酚氧化酶(PPO)對(duì)酪蛋白進(jìn)行交聯(lián)，考察交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性，并采用SDSPAGE電泳檢測(cè)交聯(lián)物的形成情況。結(jié)果表明：當(dāng)PPO酶比活力為400U/mL，25℃反應(yīng)4h時(shí)，交聯(lián)后的酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為18.3m2/g和19.8min，較未交聯(lián)的酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了17.3%和37.5%。交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性得到顯著提高，并且與形成的聚合物含量有著密切的關(guān)系。

雙孢蘑菇多酚氧化酶；酪蛋白；交聯(lián)；乳化性；穩(wěn)定性

Abstract：Cross-linking of food proteins can modify their functional properties. Casein was cross-linked by polyphenol oxidase from Agaricus bisporus. The emulsifying capacity and emulsion stability of cross-linked casein were analyzed and SDS-PAGE was used to detect the amount of polymer formation. The emulsifying capacity and emulsion stability of cross-linked casein obtained after polyphenol oxidase treatment at 25 ℃ and an enzyme concentration of 400 U/mL for 4 h were 18.3 m2/g and 19.8 min, 17.3% and 37.5% higher than those of non-cross-linked casein, respectively. Such significant increments in both emulsifying properties might be tightly related to the amount of formed cross-linked casein.

Key words：Agaricus bisporus polyphenol oxidase；casein；cross-linking；emulsifying capacity；emulsion stability

對(duì)食物蛋白進(jìn)行交聯(lián)，可改善蛋白質(zhì)的功能特性，如熱穩(wěn)定性、乳化性、凝膠特性、保水性、流變學(xué)特性等[1]。近年來(lái)，利用酶對(duì)蛋白進(jìn)行交聯(lián)引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注?？捎糜诘鞍捉宦?lián)的酶主要有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、過(guò)氧化酶、多酚氧化酶等，它們可催化蛋白質(zhì)形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)[1]。目前，研究最多和最深入的是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的交聯(lián)作用[2-3]，而多酚氧化酶對(duì)蛋白的交聯(lián)作用研究相對(duì)較少。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，EC 1.14.18.1) 是一種含銅金屬酶，普遍存在于各種植物、真菌和昆蟲(chóng)中。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PPO能催化多種蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，如小麥醇溶蛋白[4]、α-乳白蛋白[5]、β-乳球蛋白[5]、溶菌酶[5]、蚌類蛋白[6]、原膠原蛋白[7]、β-酪蛋白[8]和麩質(zhì)[9]等，但是暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)牛乳中全部酪蛋白進(jìn)行交聯(lián)的研究。目前，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)PPO交聯(lián)食物蛋白方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用雙孢蘑菇多酚氧化酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行交聯(lián)，研究了PPO酶比活力、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)酪蛋白交聯(lián)后乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，旨在通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)改善酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮牛奶 江西南昌陽(yáng)光乳業(yè)有限公司；咖啡酸Sigma-aldrich公司；鄰苯二酚、丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra 64R 高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Backman公司；中空纖維超濾器 北京市宣武超濾設(shè)備廠；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FJ-200 高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；PB-10 型酸度計(jì) 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的制備

將鮮牛奶脫脂后用1mol/L HCl調(diào)pH值至4.6，40℃保溫30min沉淀酪蛋白，將酪蛋白冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆?。稱取酪蛋白2g，加入0.1mol/L NaOH 20mL，60℃溶解后用0.1mol/L HCl調(diào)整溶液的pH值為7.0，最后用蒸餾水定容到100mL，即得0.02g/mL酪蛋白溶液。

1.3.2 PPO粗酶液的制備

將從市場(chǎng)上買來(lái)的新鮮雙孢蘑菇去皮、切碎，放入研缽中，加入液氮，迅速用杵搗碎至無(wú)明顯顆粒的粉末狀。加入預(yù)冷丙酮(－20℃)，用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，即得丙酮粉，－20℃保存?zhèn)溆?。取冷凍干燥丙酮?.2g，加入10mL預(yù)冷(4℃)的0.05mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌25～30min，7000r/min離心20min，上清液即為粗酶液[10]。

1.3.3 PPO交聯(lián)對(duì)酪蛋白功能特性影響的實(shí)驗(yàn)方案

反應(yīng)體系為1g/mL酪蛋白溶液，在酪蛋白溶液中加入100mmol/L咖啡酸使其終濃度為1mmol/L，然后加入PPO粗酶液，使酶與溶液比分別達(dá)到200、400、600、800U/mL和1000U/mL，最后補(bǔ)充蒸餾水使酪蛋白溶液終質(zhì)量濃度為0.01g/mL，混勻，15～35℃分別反應(yīng)1～8h后，80℃加熱5min停止反應(yīng)。冷卻至室溫后測(cè)定蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性，對(duì)照不加酶液。

1.3.4 酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

反應(yīng)條件同1.3.3節(jié)，結(jié)束后立即測(cè)定溶液的乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)。采用Liu等[11]的方法并稍有改變：取反應(yīng)混合物10mL，加入大豆色拉油3mL，然后以10000r/min高速均質(zhì)2min，立即或10min后用微量吸液器從底部抽取乳狀液10μL，與5mL 0.1% SDS混合，在分光光度計(jì)上500nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。EAI(m2/g)和ESI (min)采用如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：T為2.303；C為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)量濃度/(g/mL)；φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)；A0為均質(zhì)后迅速被稀釋的乳化液的吸光度；A10min為乳化液在靜止10min后的吸光度；t為時(shí)間(本實(shí)驗(yàn)是10min)。

1.3.5 PPO酶比活力測(cè)定

參照Gawlik-Dziki[12]等的方法，用0.05mol/L、pH7.0磷酸鹽緩沖液配制0.04mol/L鄰苯二酚溶液，取2.8mL鄰苯二酚溶液，加入0.2mL粗酶液，混勻后在420nm波長(zhǎng)處比色，酶液加入后開(kāi)始計(jì)時(shí)，每30s記錄1次OD420nm隨時(shí)間的變化值，以最初直線段的斜率計(jì)算酶比活力。一個(gè)酶活力單位定義為在測(cè)定條件下，每分鐘引起光密度值改變0.001所需的酶量。

1.3.6 交聯(lián)聚合物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)[13]

在酪蛋白溶液中加入100mmol/L咖啡酸使其終濃度為1mmol/L，然后加入PPO粗酶液，使酶與溶液比為400U/mL，最后補(bǔ)充蒸餾水使酪蛋白溶液終濃度為0.01g/mL，混勻，25℃分別反應(yīng)1～8h后，80℃加熱5min停止反應(yīng)。取10μL樣品加入等體積的上樣緩沖液，煮沸3～5min后取4μL上樣。采用5%的濃縮膠和15%的分離膠，濃縮膠中10mA 電泳20min，分離膠中30mA電泳50min左右。電泳完畢采用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行光密度掃描分析，對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行相對(duì)定量。

蛋白條帶相對(duì)含量=條帶的平均光密度(OD)×條帶面積/mm2。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO酶比活力對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

表1 PPO酶比活力對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Table 1 Effect of PPO activity on emulsifying activity and emulsion stability of cross-linked casein

由表1可知，交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性較對(duì)照組均有所提高。當(dāng)酶比活力為400U/mL和800U/mL時(shí)，酪蛋白乳化性相對(duì)較高，分別為13.6m2/g和14.2m2/g，對(duì)照組僅為11.5m2/g。當(dāng)酶比活力為600U/mL時(shí)，酪蛋白乳化穩(wěn)定性最高，達(dá)到了18.8min，其次為酶比活力為200U/mL和1000U/mL時(shí)，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性分別為18.1min和18.2min，而對(duì)照組為15.5min。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on emulsifying activity and emulsion stability of cross-linked casein

由圖1可知，在15～35℃的范圍內(nèi)，交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均比對(duì)照組高。反應(yīng)溫度對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性的影響不太明顯。反應(yīng)溫度為30℃時(shí)酪蛋白乳化性最小，為19.0m2/g，其他反應(yīng)溫度下酪蛋白乳化性變化較小，均在20.5m2/g左右，而對(duì)照組酪蛋白的乳化性僅為16.8m2/g。反應(yīng)溫度在15～25℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性逐漸升高，25℃時(shí)達(dá)到最高，為32.9min。當(dāng)反應(yīng)溫度高于25℃時(shí)，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性隨著溫度的升高而降低，35℃時(shí)僅為20.6min，但仍比對(duì)照組(15.1min)高很多。

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of incubation time on emulsifying activity and emulsion stability of cross-linked casein

將反應(yīng)混合物置于25℃分別反應(yīng)1、2、4、6h和8h，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)交聯(lián)后酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖2所示。反應(yīng)時(shí)間在1～4h范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，酪蛋白乳化性也隨之增加，在4h時(shí)達(dá)到最高，為18.3m2/g；而在4～8h內(nèi)，酪蛋白的乳化性先減小后增加，但交聯(lián)后酪蛋白的乳化性均比交聯(lián)前高。在1～8h范圍內(nèi)，酪蛋白的乳化穩(wěn)定性隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而減少。反應(yīng)1h的酪蛋白乳化穩(wěn)定性最高，達(dá)到了22.0min，而反應(yīng)8h的酪蛋白乳化穩(wěn)定性最小，為16.7min。

因此，當(dāng)PPO酶比活力為400U/mL、25℃反應(yīng)4h時(shí)，交聯(lián)后的酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為18.3m2/g和19.8min，與未交聯(lián)的酪蛋白相比較，乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了17.3%和37.5%。另外，通過(guò)t檢驗(yàn)可知，在此反應(yīng)條件下，交聯(lián)前后酪蛋白的乳化性差異顯著(P＜0.05)，乳化穩(wěn)定性差異極顯著(P ＜0.01)。

2.4 聚合物含量對(duì)酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

采用SDS-PAGE電泳觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)酪蛋白交聯(lián)的影響(圖3)，并對(duì)聚合物進(jìn)行光密度掃描分析，結(jié)果如圖4所示。在1～4h范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白相對(duì)含量逐漸減少，聚合物相對(duì)含量逐漸增多。而在4～8h范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白含量和聚合物含量反而有所降低。而從2.3節(jié)分析中可知，在相同的交聯(lián)條件下，反應(yīng)時(shí)間在1～4h范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，酪蛋白乳化性也隨之增加，在4～8h內(nèi)，酪蛋白的乳化性呈先減小后增加的趨勢(shì)，而酪蛋白的乳化穩(wěn)定性在1～8h范圍內(nèi)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而減少。由此可知，交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性與形成的聚合物的含量有著密切的關(guān)系，但并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酪蛋白交聯(lián)的影響Fig.3 Effect of incubation time on cross linking of casein

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酪蛋白和聚合物相對(duì)含量的影響Fig.4 Effect of incubation time on casein and polymer formation

3 結(jié) 論

通過(guò)調(diào)節(jié)PPO酶比活力、反應(yīng)溫度和時(shí)間，可以提高交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。當(dāng)PPO酶比活力為400U/mL，25℃反應(yīng)4h時(shí)，交聯(lián)后的酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為18.3m2/g和19.8min，較未交聯(lián)的酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了17.3%和37.5%，并且交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性與形成的聚合物的含量有著密切的關(guān)系。

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Emulsify Capacity and Stability of Cross-linked Casein with Polyphenol Oxidase from Agaricus bisporus

WU Jin-ju1,2，GAO Jin-yan1,3，LIU Xiao1,2，CHENG Wei1,2，CHEN Hong-bing1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

TQ93

A

1002-6630(2010)15-0117-04

2010-04-22

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z324)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ09063)；江西省研究生創(chuàng)新資金項(xiàng)目

吳進(jìn)菊(1983—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wujinju302@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：chbgjy@hotmail.com