篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長的抑制作用

柳 嘉， David G. Popovich，景 浩,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 新加坡國立大學(xué)化學(xué)系，新加坡 117543)

篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長的抑制作用

柳 嘉1， David G. Popovich2，景 浩1,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 新加坡國立大學(xué)化學(xué)系，新加坡 117543)

目的：研究篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長抑制作用及其作用機(jī)理。方法：采用MTT法觀察細(xì)胞生長抑制并確定半數(shù)抑制濃度(IC50)，LDH(lactate dehydrogenase)法評價提取物引起的細(xì)胞膜損傷，流式細(xì)胞計法測定細(xì)胞周期，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果：篤斯越橘花青素提取物能夠有效地抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的生長且IC50約為214μg/mL；LDH實驗表明細(xì)胞LDH釋放率在24、48、72h分別為89.0%、85.2%、67.8%，72h時相對24h或48h明顯降低(P＜0.05)，提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞膜的通透性未見明顯增加；篤斯越橘花青素提取物能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時在S或G0/G1期產(chǎn)生阻滯，但是對細(xì)胞的G2/M期未見明顯影響，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡特征。結(jié)論：篤斯越橘花青素提取物能有效抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長的作用，具有開發(fā)為天然抗肥胖功能因子的潛在可能。

篤斯越橘花青素提取物；3T3-L1前脂肪細(xì)胞；生長抑制；細(xì)胞凋亡

篤斯越橘(Vaccinium uliginosum L.)是我國最主要的越橘屬植物之一，其果實富含黃酮類物質(zhì)，如花青素[1]、原花青素[2]、楊梅黃素[3]等。每100g篤斯越橘鮮果中花青素含量達(dá)343mg，是紅豆越橘的兩倍[4]。研究發(fā)現(xiàn)，花青素具有多種生物活性和藥物功能，如抗氧化[5]以及抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]等作用?；ㄇ嗨販p肥功效的研究在近幾年成為熱點(diǎn)[7-8]，抑制肥胖的主要途徑包括減少能量攝入，增加能量支出，減少前脂肪細(xì)胞分化和增殖，減少脂肪細(xì)胞脂肪合成，增加脂肪分解和氧化等。前脂肪細(xì)胞可轉(zhuǎn)化成為成熟脂肪細(xì)胞并增加脂肪組織，因此抑制前脂肪細(xì)胞生長是抗肥胖非常重要的一個途徑[9]。本研究從篤斯越橘花青素提取物抑制細(xì)胞增殖、改變細(xì)胞膜通透性和引起細(xì)胞凋亡角度，研究篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的抑制作用。以期為進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用篤斯越橘資源提供有益的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘花青素提取物(bog bilberry anthocyanin extract，BBAE；花青素含量為25%) 大興安嶺華野生物工程有限公司；Swiss小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞株ATCC公司。

胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 新加坡1st Base公司；十二烷基磺酸鈉(SDS) 國藥控股沈陽有限公司；DMEM培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、碘化丙啶(PI)、輔酶I(NADH)、丙酮酸鈉 Sigma公司；0.04%臺盼藍(lán)溶液 美國MP Biomedicals公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%， EDTA 0.52 mmol/L) 加拿大Gibco公司；細(xì)胞周期反應(yīng)液 美國Guava科技公司；其他試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全波長酶標(biāo)儀 美國熱電集團(tuán)；BIO-RAD680酶標(biāo)儀 美國伯樂公司；倒置顯微鏡、CX3生物顯微鏡、C-5060數(shù)碼相機(jī) 日本Olympus公司；PCA流式細(xì)胞計 美國Guava科技公司。

1.33 T3 -L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100U/L青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中(以下簡稱DMEM10)，于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合時，用胰蛋白酶-EDTA溶液化細(xì)胞。

1.4 MTT實驗

取9 6孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，3T3-L1前脂肪細(xì)胞為2.5×104個/mL。96孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL含有不同質(zhì)量濃度的篤斯越橘花青素提取物的培養(yǎng)液(150～1500μg/mL)，以不含有樣品的DMEM10為空白對照，溫箱孵育72h。除去培養(yǎng)液后，加入含有0.5mg/mL MTT的DMEM10培養(yǎng)基孵育4h，再加入100μL的0.1g/mL SDS(含0.1mol/L HCl)溶液過夜，以完全溶解出MTT紫色結(jié)晶產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀在570nm處(以630nm為參考波長)測定光密度值。實驗重復(fù)3次。以藥物濃度的對數(shù)與細(xì)胞存活率進(jìn)行直線回歸并求出 IC50(半數(shù)抑制濃度，即細(xì)胞存活率為50%時所需要的提取物的濃度)[10]。

1.5 乳酸脫氫酶釋放量檢測

取24孔培養(yǎng)板，每孔加入1mL 3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液，濃度為5×104個/mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入1mL含有相應(yīng)IC50的篤斯越橘花青素提取物的培養(yǎng)液，以不含有樣品的DMEM10為空白對照，分別于24、48、72h收集上清液，500×g離心10min。取50μL離心后的上清液與2mL的Tris-EDTA-NADH溶液(含有50mmol/L Tris緩沖液，pH 7.4，37℃；5mmol/L EDTA；150μmol/L NADH)混合，溫箱孵育12min，再加入200μL預(yù)熱(37℃)過的13.5mmol/L丙酮酸鈉溶液，混合均勻，于37℃、340nm波長用酶標(biāo)儀測定3min內(nèi)每分鐘OD值的下降數(shù)值(ΔOD值)。實驗重復(fù)3次，3個平行測定。結(jié)果以LDH(lactate dehydrogenase)釋放率(樣品LDH釋放量與對照LDH釋放量之比)表示。每分鐘的ΔOD值下降率是每分鐘樣品ΔOD值與對照ΔOD值的比值，LDH釋放率則為3min內(nèi)每分鐘ΔOD值下降率之和的均值[10]。

1.6 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡測定

取24孔培養(yǎng)板，每孔加入1mL 3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液，濃度為5×104個/mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入1mL含有相應(yīng)IC50的篤斯越橘提取物的培養(yǎng)液孵育，以不含有樣品的DMEM10為空白對照，實驗重復(fù)3次，3個平行測定。分別于24、48、72h棄去培養(yǎng)液， 用1mL PBS溶液清洗細(xì)胞層，洗液收集至離心管中。每孔加入500μL 胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化10min，加入1mL DMEM10培養(yǎng)液終止反應(yīng)，將細(xì)胞懸液打勻后加入離心管中。以1mL PBS溶液清洗各孔，洗液收集至離心管中。離心管于500×g離心5min。小心吸去上清液，用1mL PBS溶液打勻細(xì)胞并500×g離心5 min，重復(fù)一次。去除上清液后，邊劇烈振蕩邊向細(xì)胞沉淀中逐滴加入1mL預(yù)冷至－20℃的70%乙醇。置于4℃過夜。過夜后的溶液于500×g離心5min，小心吸去上清液，用1mL PBS溶液打勻細(xì)胞并500×g離心5min，重復(fù)一次。 去除上清液后， 加入200μL Guava細(xì)胞周期反應(yīng)液并打勻。避光室溫放置30min。于流式細(xì)胞計檢測細(xì)胞周期，用Guava CytoSoft軟件處理數(shù)據(jù)。

1.7 熒光顯微鏡觀察

取94mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，濃度為5×104個/皿， 貼壁培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，向皿中加入5mL含有相應(yīng)IC50的篤斯越橘提取物的培養(yǎng)液，以不含有樣品的DMEM10為空白對照。孵育72h后棄去培養(yǎng)液， 用5mL PBS溶液輕柔清洗細(xì)胞層，重復(fù)一次。緩慢加入5mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.7%福爾馬林，覆蓋細(xì)胞層，室溫放置15min。去除福爾馬林后，用5mL PBS溶液輕柔清洗細(xì)胞層，重復(fù)一次。 緩慢加入5mL預(yù)冷至－20℃甲醇，覆蓋細(xì)胞，室溫放置5min。去除甲醇，用5mL PBS溶液輕柔清洗細(xì)胞層2次。避光緩慢加入3mL的50 μg/mL PI染液，溫箱孵育30min。去除染液后，用PBS溶液輕柔清洗細(xì)胞層2次，于超凈臺上放置直至干燥。于熒光顯微鏡下放大400倍觀察細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果以x±s表示。LDH數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS12.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，鄧肯氏多重檢驗用來確定數(shù)據(jù)間的顯著性差異，顯著水平設(shè)定為P＜0.05；細(xì)胞周期數(shù)據(jù)組間結(jié)果(兩組數(shù)據(jù))采用兩組資料的t檢驗，顯著水平設(shè)定為P＜0.05 。

2 結(jié)果與分析

2.1 篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞的生長抑制

圖1 篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長抑制作用的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig.1 Cell growth inhibition effect of BBAE on 3T3-L1 preadipocytes

由圖1可知，篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞有明顯生長抑制作用。隨著篤斯越橘花青素提取物質(zhì)量濃度的升高(150～900μg/mL)，其抑制細(xì)胞生長的能力增強(qiáng)，劑量效應(yīng)關(guān)系明顯，細(xì)胞存活率從約100%降至10%。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度介于900～1500μg/mL時，細(xì)胞存活率基本不變。以細(xì)胞存活率與提取物質(zhì)量濃度的對數(shù)進(jìn)行直線回歸并求出IC50。經(jīng)計算，篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長抑制的IC50為(213.9 ± 19.6)μg/mL。

2.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的LDH釋放量檢測

圖2顯示出3T3-L1前脂肪細(xì)胞LDH釋放率與時間的關(guān)系。經(jīng)處理24、48、72h LDH釋放率分別為89.0%、85.2%、67.8%，48h和72h相對24h時分別減少了4%和21%。3T3-L1前脂肪細(xì)胞在3個時間段LDH釋放率均低于100%，說明處理組和對照組相比沒有更多的LDH釋放，即篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞膜通透性未見明顯變化。經(jīng)統(tǒng)計分析，處理48h的3T3-L1前脂肪細(xì)胞LDH釋放率與24h相比無明顯差異，但72h與24h或48h相比均有明顯降低(P＜0.05)。研究原始數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)(未列出)，對照組細(xì)胞的LDH釋放量隨時間延長緩慢增長，但處理組細(xì)胞的LDH釋放量基本保持不變，導(dǎo)致72h時細(xì)胞LDH釋放率有顯著減少。

圖2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞LDH釋放率Fig.2 LDH activity in 3T3-L1 preadipocytes after incubation for different periods of time in the presence of BBAE

2.3 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期變化

經(jīng)過相應(yīng)的IC50篤斯越橘花青素提取物處理，3T3-L1前脂肪細(xì)胞分別在24、48、72h于流式計上測定細(xì)胞周期的變化。用Guava CytoSoft軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析，表1為3T3-L1前脂肪細(xì)胞空白對照組和處理組細(xì)胞各個時期細(xì)胞組成的比例。每個時間段Sub-G1期的細(xì)胞，處理組均多于對照組；且隨時間的增加(24～72h)，處理組的Sub-G1期即凋亡細(xì)胞明顯增多，24h至72h凋亡細(xì)胞比例從1%上升至14%；G2/M期細(xì)胞數(shù)量則未見明顯變化；72h時G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)；24h時S期細(xì)胞數(shù)量顯著下降(P＜0.05)，72h時則增多(P＜0.05)。 篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞有生長抑制作用，但沒有明顯改變細(xì)胞膜的通透性，卻改變了細(xì)胞周期，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

表1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞周期的變化Table 1 Cell cycle distribution of 3T3-L1 preadipocytes after incubation for different periods of time in the presence of BBAE

2.4 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)觀察

圖3 篤斯越桔花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)Fig.3 Morphological micrographs of 3T3-L1 preadipocytes after incubation for 72 h with and without the presence of BBAE (×400)

將處理72h的3T3-L1前脂肪細(xì)胞固定并染色，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖3所示。對照組的細(xì)胞完整，細(xì)胞核集中，生長狀況良好。而處理組的細(xì)胞相對分散，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞間連接基本消失，失去纖維狀形態(tài)；細(xì)胞核內(nèi)具有典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征：如細(xì)胞核固縮、體積縮小，核染色質(zhì)邊集聚，凝聚成大小不同的塊，斷裂分散到細(xì)胞質(zhì)中，可見致密濃染的黃色熒光。

3 討 論

研究表明，篤斯越橘花青素提取物對Swiss小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1有明顯的生長抑制作用，且呈劑量效應(yīng)。對其生長抑制機(jī)理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)篤斯越橘花青素提取物處理后，LDH釋放率在24h和48h沒有增加，在72h減少，表明篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的抑制作用，不是由改變細(xì)胞膜通透性途徑實現(xiàn)的。Fantinelli等[11]用無酒精的阿根廷紅酒花青素對Wistar大鼠心臟進(jìn)行缺血再灌注損傷，與對照組相比L D H釋放量較對照組降低。Marcollet等[12]用越橘花青素喂養(yǎng)SD大鼠，3min后發(fā)現(xiàn)血漿中的LDH釋放量較對照組小。這些報道與本研究結(jié)果相一致，表明篤斯越橘花青素提取物不是通過改變細(xì)胞膜通透性途徑抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的生長，可能是通過直接和LDH結(jié)合改變3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞膜性質(zhì)[13]。提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞膜性質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。

本實驗結(jié)果顯示，篤斯越橘花青素提取物能夠有效誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期Sub-G1期凋亡細(xì)胞量有顯著提高(P＜0.05)，呈時間效應(yīng)，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)典型凋亡特征。由于前脂肪細(xì)胞可轉(zhuǎn)化成為成熟脂肪細(xì)胞，因此抑制前脂肪細(xì)胞生長是抗肥胖的一個重要途徑[9]。有研究顯示，一些天然產(chǎn)物可以抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如蘆丁、柚皮素、柚皮苷、橙皮苷、白藜蘆醇和染料木黃酮等[14-15]。篤斯越橘花青素提取物能有效抑制前脂肪細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，因此具有開發(fā)為抗肥胖食品的潛力。

近幾年發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞凋亡存在多種途徑。槲皮素可通過降低線粒體膜電位，減少多聚(ADP-核糖)聚合酶合成等途徑誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡[16]。茶多酚可以影響細(xì)胞周期蛋白激酶CDK2表達(dá)，最終抑制細(xì)胞有絲分裂[17]。辣椒素通過激發(fā)半胱氨酸蛋白酶-3等途徑抑制前脂肪細(xì)胞生長并誘導(dǎo)產(chǎn)生大量凋亡細(xì)胞[18]。篤斯越橘花青素提取物誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的途徑有待進(jìn)一步的研究。

綜合MTT和LDH實驗結(jié)果，篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞有生長抑制作用，其生長抑制機(jī)理不是通過改變細(xì)胞膜的通透性，而是通過改變細(xì)胞周期并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到對3T3-L1細(xì)胞的生長抑制效果。

4 結(jié) 論

篤斯越橘花青素提取物對Swiss小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1有明顯的生長抑制作用，且呈劑量效應(yīng)，IC50約為214μg/mL。

經(jīng)篤斯越橘花青素提取物處理后，3T3-L1細(xì)胞的LDH釋放率沒有增加(24～48h)，反而在72h有減少。細(xì)胞生長抑制作用不是通過提取物改變細(xì)胞膜通透性實現(xiàn)的。

篤斯越橘花青素提取物能夠有效誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期Sub-G1期凋亡細(xì)胞量有顯著提高(P＜0.05)， 細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡特征。

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Growth Inhibition Effect of Bog Bilberry Anthocyanin Extract on 3T3-L1 Preadipocytes

LIU Jia1，David G. Popovich2，JING Hao1,*
( 1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；
2. Department of Chemistry, National University of Singapore, Singapore 117543, Singapore)

Objective: To study the inhibition effect and its mechanism of bog bilberry (Vaccinium uliginosum L.) anthocyanin extract (BBAE) on the growth of 3T3-L1 preadipocytes. Methods: MTT assay, LDH (lactate dehydrogenase) assay, flow cytometry and fluorescence microscope were used for measuring cell growth inhibition (IC50), membrane permeability, cell cycle and the morphological features of apoptotic cells, respectively. Results: BBAE effectively inhibited the growth of 3T3-L1 preadipocytes in a dosage-dependent way, with an IC50 of approximately 214μg/mL. 3T3-L1 preadipocytes showed a significant (P＜0.05) lower LDH release (67.8%) after exposure to BBAE for 72 h than for 24h (89.0%) and 48 h (85.2%). No obvious improvement in the membrane permeability in 3T3-L1 preadipocytes was observed after BBAE treatment. BBAE effectively induced apoptosis of 3T3-L1 preadipocytes, significantly (P＜0.05) increased cell population in the sub-G1 phase, had no significant effect in the G2/M phase and exhibited a block in the S and G0/G1 phases. After incubation for 72 h in the presence of BBAE, 3T3-L1 preadipocytes exhibited typical apoptosis features observed under fluorescence microscope.

bog bilberry anthocyanin extract；3T3-L1 preadipocytes；growth inhibition；apoptosis

R282.71

A

1002-6630(2010)15-0248-05

2010-01-06

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(2009-2-11)

柳嘉(1985—)，女，碩士，研究方向為營養(yǎng)與食品安全。E-mail：jessicaliujia@gmail.com

*通信作者：景浩(1957—)，男，教授，博士后，研究方向為營養(yǎng)與安全。E-mail：haojing@cau.edu.cn