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      穿琥寧體外穩(wěn)定性研究

      2010-09-13 01:38:38王鵬江云鷗張志勇四川大學(xué)華西藥學(xué)院成都市610041四川大學(xué)華西醫(yī)院藥劑科成都市610041
      中國(guó)藥房 2010年39期
      關(guān)鍵詞:腸液胰酶穿心蓮

      王鵬,江云鷗,張志勇(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院,成都市 610041;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院藥劑科,成都市 610041)

      穿琥寧體外穩(wěn)定性研究

      王鵬1,2*,江云鷗1,2,張志勇2#(1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院,成都市 610041;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院藥劑科,成都市 610041)

      目的:研究穿琥寧的體外酸堿及酶穩(wěn)定性。方法:將穿琥寧溶解于不同pH值(2.0~9.0)的磷酸緩沖液、人工腸液和不同濃度的肝組織勻漿液中,37℃恒溫水浴,于不同時(shí)間取樣,高效液相色譜法測(cè)定穿琥寧的濃度,考察其降解情況或降解動(dòng)力學(xué)。結(jié)果:穿琥寧在酸性(pH 2.0~5.0)條件下迅速降解(溫孵1 h后殘余量低于10%);在pH 7.0磷酸溶液、人工腸液中相對(duì)穩(wěn)定,2 h內(nèi)各取樣點(diǎn)的穿琥寧含量均高于95%;37℃下,在50%肝勻漿液中溫孵24 h后,降解23%;在25%肝勻漿液中溫孵24 h后,降解15%,且隨肝勻漿液濃度的增大而降解加快。結(jié)論:穿琥寧在pH<5.0的環(huán)境下極不穩(wěn)定;而胰酶對(duì)其幾無影響;在肝勻漿液(pH 7.0)中不穩(wěn)定,肝微粒體酶對(duì)其有一定影響。

      穿琥寧;肝勻漿;酸堿穩(wěn)定性;酶穩(wěn)定性

      穿琥寧(Potassium Dehydroandrographolide Succinate,PDS)是以穿心蓮葉提取之穿心蓮內(nèi)酯在吡啶催化下與琥珀酸酐反應(yīng)所得的穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽[1],具有抗菌消炎、清熱解毒、促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能及鎮(zhèn)靜作用。目前多以靜脈注射給藥,但殘留其中的吡啶容易引起副作用,且使用不方便。鄭永等[1]將PDS制備成腸溶膠囊,回避了胃液對(duì)其的降解問題[2],但研究結(jié)果表明,其絕對(duì)生物利用度仍然較低。此外諸如中空栓劑[3]等非注射制劑,生物利用度也均不理想。為此,筆者考察了PDS在不同pH值溶液、人工腸液、大鼠肝勻漿液中的穩(wěn)定性,采用體外方法探討胃液、腸液及肝微粒體酶可能產(chǎn)生的影響,推測(cè)其口服生物利用度較低的原因,為該藥制劑的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

      1 儀器與材料

      1.1 儀器

      UV-2401型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);LC-10AT-vp型高效液相色譜(HPLC)儀、SPD-M10Avp型紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司);pHS-4C型pH計(jì)(成都方舟電子有限公司);TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);ZSQ型恒溫水浴鍋(上海志成分析儀器制造有限公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);YKH-I型快速混合器(北京泰立電子技術(shù)有限公司)。

      1.2 試藥

      胰酶(美國(guó)Sigma公司);脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):111598-200807);穿琥寧原料藥(四川廣漢市維康植化有限公司,批號(hào):070228);水為純化水,甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

      1.3 動(dòng)物

      SD大鼠5只,♀,體質(zhì)量約170 g,由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):0003481)。

      2 方法

      2.1 色譜條件[4]

      色譜柱:Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.05%KH2PO4水溶液(pH 2.51,65∶35);流速:1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 mL;檢測(cè)波長(zhǎng):251 nm。

      2.2 不同pH值溶液[5]與肝勻漿液的制備

      稱取磷酸二氫鉀3.4 g,加水溶解稀釋至500 mL,分成10份,每份50 mL,4份用磷酸分別調(diào)pH至 2.06、3.03、3.99、4.49,另6份用1%氫氧化鈉分別調(diào)pH至5.01、5.50、6.01、7.00、7.98、9.01。

      SD大鼠禁食過夜,斷頭處死,立即取肝臟,剔去脂肪與結(jié)締組織,冰浴下以生理鹽水洗去殘留血液,再冰浴下以20%磷酸緩沖液(pH 7.0)手動(dòng)勻漿,即得。

      2.3 PDS在不同pH值磷酸緩沖液中的穩(wěn)定性

      精密稱取真空干燥至恒重的PDS 3.9 mg若干份,用不同pH值磷酸緩沖液50 mL溶解混勻后,置于37℃水浴中,水浴1 h后迅速冷卻至室溫,以微孔濾膜濾過,各取20 μL,測(cè)定PDS濃度。

      2.4 PDS在最適pH值溶液、人工腸液(不含胰酶)、人工腸液(含有胰酶)[6,7]中的穩(wěn)定性

      精密稱取真空干燥至恒重的PDS 3.9 mg,溶于pH 7.00溶液與人工腸液(不含胰酶)各50 mL中,混勻,置于37℃水浴中,20 min后取樣1次,迅速冷卻至室溫,以微孔濾膜濾過,各取20 μL,測(cè)定PDS濃度。

      精密稱取PDS 30.9 mg,定容于10 mL50%甲醇液中,取5 mL于人工腸液(含胰酶)中制成50 mL溫孵液,置于37.5℃水浴中,每20 min取樣1 mL,迅速添加冰乙腈3 mL,5 000 r·min-1離心10 min,取上清各20 μL,測(cè)定PDS濃度。

      2.5 PDS在肝勻漿液中的穩(wěn)定性

      分別精密稱取PDS 3.6 mg若干份,分別溶解于25 mL 50%肝勻漿液、25 mL 50%煮沸滅活肝勻漿液、25 mL 25%肝勻漿液、25 mL 25%煮沸滅活肝勻漿液中,(37.5±0.5)℃水浴溫孵,分別于0、1、2、4、8、24 h各取1 mL,添加3 mL冰乙腈,漩渦2 min混勻,5 000 r·min-1離心10 min,取上清20 μL進(jìn)樣,測(cè)定PDS濃度。

      3 結(jié)果

      3.1 PDS各模擬生物液和肝勻漿液中分析方法的建立

      在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下,肝勻漿液中的雜質(zhì)不干擾樣品測(cè)定,PDS的保留時(shí)間為9.0 min左右,分離效果較好。

      在模擬pH液中,標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=21 019.095 28C-24 446.520 24(r=0.999 9),線性范圍為14.88~178.56 μg·mL-1;平均回收率介于96.45%~99.80%之間,精密度RSD<2%。在肝勻漿液(25%)中,標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=90 326.482 03C-19 040.503 97(r=0.999 9),線性范圍為16.8~463.2 μg·mL-1;平均回收率介于96%~105%之間,日內(nèi)精密度RSD<1%,日間精密度RSD<2%。PDS的HPLC見圖1。

      圖1 穿琥寧的HPLC圖A.空白肝勻漿;B.PDS肝勻漿Fig 1 HPLC chromatograms of PDSA.blank liver homogenate;B.blank liver homogenate with PDS

      3.2 PDS在不同溶液中的穩(wěn)定性

      在pH<4.5段,溫孵1 h后,PDS完全降解;在4.5<pH<5.5段,PDS有不同程度的降解,該pH區(qū)域是PDS降解程度變化較大的區(qū)域;5.5<pH<8.0段,溫孵1 h后,PDS少量或者幾乎無降解;pH 7.0為PDS的最適pH值。不同pH值條件下PDS的穩(wěn)定性見圖2。

      人工胃液pH值為1.5~2.0,說明PDS在人工胃液中極不穩(wěn)定,與文獻(xiàn)報(bào)道家兔ig PDS無法測(cè)得血藥濃度的原因[2]相符。故選擇在人工腸液中測(cè)定PDS降解率。

      3.3 PDS在人工腸液中的降解率

      37℃下溫孵1 h,PDS在pH 6.0~8.0段較穩(wěn)定,2 h內(nèi)各取樣點(diǎn)的濃度均高于96%。進(jìn)一步觀察在pH 7.0下PDS降解情況,37℃溫孵2 h后,PDS在pH 7.0溶液僅少量降解(低于3%),2 h內(nèi)各取樣點(diǎn)PDS濃度均高于97%。pH 7.0下PDS的穩(wěn)定性見圖2。

      當(dāng)藥物進(jìn)入人體消化道后,降解不僅受pH值的影響,還受到人體眾多消化酶的影響,為此考察PDS在人工腸液中的降解情況。人工腸液的pH為6.8,同時(shí)在不含胰酶的人工腸液與含有胰酶的人工腸液中37℃溫孵2 h,各取樣點(diǎn)下PDS的含量均高于95%,后經(jīng)SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩者之間無顯著差異(P<0.05)。人工腸液中PDS的穩(wěn)定性見圖3。

      圖2 穿琥寧的穩(wěn)定性A.不同pH值條件下;B.pH 7.0;C.人工腸液中Fig 2 The stability of PDSA.at different pH value;B.pH 7.0;C.stimulated intestinal fluid

      圖3 穿琥寧降解過程(n=3)A.在50%肝組織勻漿中;B.在25%肝組織勻漿中Fig 3 Degradation process of PDS(n=3)A.50%liver homogenate;B.25%liver homogenate

      3.4 PDS肝組織勻漿液中的降解動(dòng)力學(xué)

      結(jié)果表明,PDS在50%、25%肝組織勻漿中均有一定程度的降解,而在相應(yīng)濃度的滅活肝勻漿液中,PDS則較穩(wěn)定。2組實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間PDS濃度具有明顯差異。PDS降解過程見圖5。

      由圖5可知,當(dāng)PDS濃度為50%時(shí),t1/2=27.26 h;濃度為25%時(shí),t1/2=42.77 h。

      4 討論

      PDS作為一個(gè)常用的抗菌消炎藥,臨床應(yīng)用的劑型主要是注射劑等,藥動(dòng)學(xué)研究也大多集中在iv后的藥動(dòng)學(xué)上,對(duì)于其口服體內(nèi)過程的研究較為欠缺。本研究旨在通過體外考察PDS的穩(wěn)定性,探討生物利用度較低的原因,結(jié)合已有文獻(xiàn)資料,考察PDS的主要代謝部位。

      本研究發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)低pH環(huán)境極為敏感,在pH<4.5的模擬胃腸道環(huán)境中,1 h后即完全降解,印證了張志勇等[2]給家兔直接ig PDS卻無法測(cè)得血藥濃度的結(jié)論。在4.5<pH<5.5的環(huán)境中,PDS有不同程度的降解,而腸道中局部pH可達(dá)到該區(qū)間,推測(cè)鄭永等[1]對(duì)小鼠結(jié)扎幽門,腸腔注射PDS,而絕對(duì)生物利用度低下的原因可能是因?yàn)榫植縫H較低,使得PDS部分降解。

      胰酶對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腸道胰酶對(duì)PDS幾無影響。但小腸上皮細(xì)胞中也存在CYP450藥物代謝酶系。

      37℃下溫孵24 h,發(fā)現(xiàn)PDS在不同濃度的肝勻漿液中有不同程度的降解,說明PDS可能存在一定程度的首關(guān)效應(yīng),而肝內(nèi)及小腸上皮中均可能存在代謝該藥的酶。

      PDS在pH低于5.0的胃腸道環(huán)境中代謝明顯快于其他組織,提示該藥可能是一個(gè)具有一定肝首關(guān)效應(yīng)且對(duì)酸堿環(huán)境極為敏感的藥物,適宜制備成能保護(hù)其不受腸道酸性環(huán)境影響,又能一定程度上減輕首關(guān)效應(yīng)的制劑。

      [1]鄭 永,陳峰杰,周遠(yuǎn)大,等.穿琥寧藥代動(dòng)力學(xué)及絕對(duì)生物利用度的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2004,21(4):349.

      [2]張志勇,廖工鐵,王炳南,等.脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].華西藥學(xué)雜志,1991,6(3):129.

      [3]劉海凈,于寶成,白秋江,等.穿琥寧中空栓的制備及質(zhì)量控制方法研究[J].中國(guó)藥房,2007,18(33):2 586.

      [4]黃 瑛,周益芬,付 平,等.HPLC法測(cè)定穿唬寧注射液的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2003,5(4):34.

      [5]鄧 鳴,劉會(huì)臣.普伐他汀在模擬體內(nèi)酸堿環(huán)境中的穩(wěn)定性[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2006,26(1):37.

      [6]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄ⅩⅤ、附錄158.

      [7]陳懷俠,杜 鵬.東莨菪堿及其大鼠肝勻漿代謝物的液相色譜-質(zhì)譜法分析[J].中草藥,2009,40(5):719.

      Study on the Stability of Potassium Dehydroandrographolide Succinate in Vitro

      WANG Peng,JIANG Yun-ou(West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China)
      WANG Peng,JIANG Yun-ou,ZHANG Zhi-yong(Dept.of Pharmacy,West China Hospital of Sichuan University,Chengdu 610041,China)

      OBJECTIVE:To investigate the stability of Potassium Dehydroandrographolide Succinate(PDS)in vitro in different pH and enzymatic solutions.METHODS:PDS was dissolved in different phosphate buffer solutions with pH of 2.0~9.0,stimulated intestinal fluid and liver homogenate of SD rats,thermostatically maintained at 37℃.The concentrations of PDS were determined by HPLC to investigate the degradation kinetics and stability of PDS.RESULTS:PDS was degraded in acid solution(pH 2.0~5.0)immediately(more than 90%PDS was degraded after 1 h of incubation),stable in phosphoric solution(pH 7.0)and stimulated intestinal fluid.The contents of PDS at different sampling points were more than 95%in 2 h.After 24 h of incubation at 37℃,23%PDS was degraded in 50%liver homogenate and 15%in 25%liver homogenate.The degradation speed up as the concentration of liver homogenate increased.CONCLUSION:PDS is instable in solution with pH<5.0 and liver homogenate(pH 7.0).The hepatomicrosome enzyme possesses effect on the stability of PDS while pancreatic enzymes is not.

      Potassium Dehydroandrographolide Succinate(PDS);Liver homogenate;Acid-based degradation;Enzymatic degradation

      R285;R97

      A

      1001-0408(2010)39-3664-03

      2009-11-09

      2010-03-12)

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