穿琥寧體外穩(wěn)定性研究

王鵬，江云鷗，張志勇（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都市 610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院藥劑科，成都市 610041）

穿琥寧體外穩(wěn)定性研究

王鵬1，2＊，江云鷗1，2，張志勇2#（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都市 610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院藥劑科，成都市 610041）

目的：研究穿琥寧的體外酸堿及酶穩(wěn)定性。方法：將穿琥寧溶解于不同pH值（2.0～9.0）的磷酸緩沖液、人工腸液和不同濃度的肝組織勻漿液中，37℃恒溫水浴，于不同時(shí)間取樣，高效液相色譜法測(cè)定穿琥寧的濃度，考察其降解情況或降解動(dòng)力學(xué)。結(jié)果：穿琥寧在酸性（pH 2.0～5.0）條件下迅速降解（溫孵1 h后殘余量低于10%）；在pH 7.0磷酸溶液、人工腸液中相對(duì)穩(wěn)定，2 h內(nèi)各取樣點(diǎn)的穿琥寧含量均高于95%；37℃下，在50%肝勻漿液中溫孵24 h后，降解23%；在25%肝勻漿液中溫孵24 h后，降解15%，且隨肝勻漿液濃度的增大而降解加快。結(jié)論：穿琥寧在pH＜5.0的環(huán)境下極不穩(wěn)定；而胰酶對(duì)其幾無影響；在肝勻漿液（pH 7.0）中不穩(wěn)定，肝微粒體酶對(duì)其有一定影響。

穿琥寧；肝勻漿；酸堿穩(wěn)定性；酶穩(wěn)定性

穿琥寧（Potassium Dehydroandrographolide Succinate，PDS）是以穿心蓮葉提取之穿心蓮內(nèi)酯在吡啶催化下與琥珀酸酐反應(yīng)所得的穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽[1]，具有抗菌消炎、清熱解毒、促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能及鎮(zhèn)靜作用。目前多以靜脈注射給藥，但殘留其中的吡啶容易引起副作用，且使用不方便。鄭永等[1]將PDS制備成腸溶膠囊，回避了胃液對(duì)其的降解問題[2]，但研究結(jié)果表明，其絕對(duì)生物利用度仍然較低。此外諸如中空栓劑[3]等非注射制劑，生物利用度也均不理想。為此，筆者考察了PDS在不同pH值溶液、人工腸液、大鼠肝勻漿液中的穩(wěn)定性，采用體外方法探討胃液、腸液及肝微粒體酶可能產(chǎn)生的影響，推測(cè)其口服生物利用度較低的原因，為該藥制劑的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2401型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；LC-10AT-vp型高效液相色譜（HPLC）儀、SPD-M10Avp型紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；pHS-4C型pH計(jì)（成都方舟電子有限公司）；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；ZSQ型恒溫水浴鍋（上海志成分析儀器制造有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；YKH-I型快速混合器（北京泰立電子技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

胰酶（美國(guó)Sigma公司）；脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111598-200807）；穿琥寧原料藥（四川廣漢市維康植化有限公司，批號(hào)：070228）；水為純化水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠5只，♀，體質(zhì)量約170 g，由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：0003481）。

2 方法

2.1 色譜條件[4]

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%KH2PO4水溶液（pH 2.51，65∶35）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)：251 nm。

2.2 不同pH值溶液[5]與肝勻漿液的制備

稱取磷酸二氫鉀3.4 g，加水溶解稀釋至500 mL，分成10份，每份50 mL，4份用磷酸分別調(diào)pH至 2.06、3.03、3.99、4.49，另6份用1%氫氧化鈉分別調(diào)pH至5.01、5.50、6.01、7.00、7.98、9.01。

SD大鼠禁食過夜，斷頭處死，立即取肝臟，剔去脂肪與結(jié)締組織，冰浴下以生理鹽水洗去殘留血液，再冰浴下以20%磷酸緩沖液（pH 7.0）手動(dòng)勻漿，即得。

2.3 PDS在不同pH值磷酸緩沖液中的穩(wěn)定性

精密稱取真空干燥至恒重的PDS 3.9 mg若干份，用不同pH值磷酸緩沖液50 mL溶解混勻后，置于37℃水浴中，水浴1 h后迅速冷卻至室溫，以微孔濾膜濾過，各取20 μL，測(cè)定PDS濃度。

2.4 PDS在最適pH值溶液、人工腸液（不含胰酶）、人工腸液（含有胰酶）[6，7]中的穩(wěn)定性

精密稱取真空干燥至恒重的PDS 3.9 mg，溶于pH 7.00溶液與人工腸液（不含胰酶）各50 mL中，混勻，置于37℃水浴中，20 min后取樣1次，迅速冷卻至室溫，以微孔濾膜濾過，各取20 μL，測(cè)定PDS濃度。

精密稱取PDS 30.9 mg，定容于10 mL50%甲醇液中，取5 mL于人工腸液（含胰酶）中制成50 mL溫孵液，置于37.5℃水浴中，每20 min取樣1 mL，迅速添加冰乙腈3 mL，5 000 r·min-1離心10 min，取上清各20 μL，測(cè)定PDS濃度。

2.5 PDS在肝勻漿液中的穩(wěn)定性

分別精密稱取PDS 3.6 mg若干份，分別溶解于25 mL 50%肝勻漿液、25 mL 50%煮沸滅活肝勻漿液、25 mL 25%肝勻漿液、25 mL 25%煮沸滅活肝勻漿液中，（37.5±0.5）℃水浴溫孵，分別于0、1、2、4、8、24 h各取1 mL，添加3 mL冰乙腈，漩渦2 min混勻，5 000 r·min-1離心10 min，取上清20 μL進(jìn)樣，測(cè)定PDS濃度。

3 結(jié)果

3.1 PDS各模擬生物液和肝勻漿液中分析方法的建立

在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，肝勻漿液中的雜質(zhì)不干擾樣品測(cè)定，PDS的保留時(shí)間為9.0 min左右，分離效果較好。

在模擬pH液中，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A＝21 019.095 28C－24 446.520 24（r＝0.999 9），線性范圍為14.88～178.56 μg·mL-1；平均回收率介于96.45%～99.80%之間，精密度RSD＜2%。在肝勻漿液（25%）中，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A＝90 326.482 03C－19 040.503 97（r＝0.999 9），線性范圍為16.8～463.2 μg·mL-1；平均回收率介于96%～105%之間，日內(nèi)精密度RSD＜1%，日間精密度RSD＜2%。PDS的HPLC見圖1。

圖1 穿琥寧的HPLC圖A.空白肝勻漿；B.PDS肝勻漿Fig 1 HPLC chromatograms of PDSA.blank liver homogenate；B.blank liver homogenate with PDS

3.2 PDS在不同溶液中的穩(wěn)定性

在pH＜4.5段，溫孵1 h后，PDS完全降解；在4.5＜pH＜5.5段，PDS有不同程度的降解，該pH區(qū)域是PDS降解程度變化較大的區(qū)域；5.5＜pH＜8.0段，溫孵1 h后，PDS少量或者幾乎無降解；pH 7.0為PDS的最適pH值。不同pH值條件下PDS的穩(wěn)定性見圖2。

人工胃液pH值為1.5～2.0，說明PDS在人工胃液中極不穩(wěn)定，與文獻(xiàn)報(bào)道家兔ig PDS無法測(cè)得血藥濃度的原因[2]相符。故選擇在人工腸液中測(cè)定PDS降解率。

3.3 PDS在人工腸液中的降解率

37℃下溫孵1 h，PDS在pH 6.0～8.0段較穩(wěn)定，2 h內(nèi)各取樣點(diǎn)的濃度均高于96%。進(jìn)一步觀察在pH 7.0下PDS降解情況，37℃溫孵2 h后，PDS在pH 7.0溶液僅少量降解（低于3%），2 h內(nèi)各取樣點(diǎn)PDS濃度均高于97%。pH 7.0下PDS的穩(wěn)定性見圖2。

當(dāng)藥物進(jìn)入人體消化道后，降解不僅受pH值的影響，還受到人體眾多消化酶的影響，為此考察PDS在人工腸液中的降解情況。人工腸液的pH為6.8，同時(shí)在不含胰酶的人工腸液與含有胰酶的人工腸液中37℃溫孵2 h，各取樣點(diǎn)下PDS的含量均高于95%，后經(jīng)SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者之間無顯著差異（P＜0.05）。人工腸液中PDS的穩(wěn)定性見圖3。

圖2 穿琥寧的穩(wěn)定性A.不同pH值條件下；B.pH 7.0；C.人工腸液中Fig 2 The stability of PDSA.at different pH value；B.pH 7.0；C.stimulated intestinal fluid

圖3 穿琥寧降解過程（n＝3）A.在50%肝組織勻漿中；B.在25%肝組織勻漿中Fig 3 Degradation process of PDS（n＝3）A.50%liver homogenate；B.25%liver homogenate

3.4 PDS肝組織勻漿液中的降解動(dòng)力學(xué)

結(jié)果表明，PDS在50%、25%肝組織勻漿中均有一定程度的降解，而在相應(yīng)濃度的滅活肝勻漿液中，PDS則較穩(wěn)定。2組實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間PDS濃度具有明顯差異。PDS降解過程見圖5。

由圖5可知，當(dāng)PDS濃度為50%時(shí)，t1/2＝27.26 h；濃度為25%時(shí)，t1/2＝42.77 h。

4 討論

PDS作為一個(gè)常用的抗菌消炎藥，臨床應(yīng)用的劑型主要是注射劑等，藥動(dòng)學(xué)研究也大多集中在iv后的藥動(dòng)學(xué)上，對(duì)于其口服體內(nèi)過程的研究較為欠缺。本研究旨在通過體外考察PDS的穩(wěn)定性，探討生物利用度較低的原因，結(jié)合已有文獻(xiàn)資料，考察PDS的主要代謝部位。

本研究發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)低pH環(huán)境極為敏感，在pH＜4.5的模擬胃腸道環(huán)境中，1 h后即完全降解，印證了張志勇等[2]給家兔直接ig PDS卻無法測(cè)得血藥濃度的結(jié)論。在4.5＜pH＜5.5的環(huán)境中，PDS有不同程度的降解，而腸道中局部pH可達(dá)到該區(qū)間，推測(cè)鄭永等[1]對(duì)小鼠結(jié)扎幽門，腸腔注射PDS，而絕對(duì)生物利用度低下的原因可能是因?yàn)榫植縫H較低，使得PDS部分降解。

胰酶對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸道胰酶對(duì)PDS幾無影響。但小腸上皮細(xì)胞中也存在CYP450藥物代謝酶系。

37℃下溫孵24 h，發(fā)現(xiàn)PDS在不同濃度的肝勻漿液中有不同程度的降解，說明PDS可能存在一定程度的首關(guān)效應(yīng)，而肝內(nèi)及小腸上皮中均可能存在代謝該藥的酶。

PDS在pH低于5.0的胃腸道環(huán)境中代謝明顯快于其他組織，提示該藥可能是一個(gè)具有一定肝首關(guān)效應(yīng)且對(duì)酸堿環(huán)境極為敏感的藥物，適宜制備成能保護(hù)其不受腸道酸性環(huán)境影響，又能一定程度上減輕首關(guān)效應(yīng)的制劑。

[1]鄭 永，陳峰杰，周遠(yuǎn)大，等.穿琥寧藥代動(dòng)力學(xué)及絕對(duì)生物利用度的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志，2004，21（4）：349.

[2]張志勇，廖工鐵，王炳南，等.脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].華西藥學(xué)雜志，1991，6（3）：129.

[3]劉海凈，于寶成，白秋江，等.穿琥寧中空栓的制備及質(zhì)量控制方法研究[J].中國(guó)藥房，2007，18（33）：2 586.

[4]黃 瑛，周益芬，付 平，等.HPLC法測(cè)定穿唬寧注射液的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2003，5（4）：34.

[5]鄧 鳴，劉會(huì)臣.普伐他汀在模擬體內(nèi)酸堿環(huán)境中的穩(wěn)定性[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（1）：37.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄ⅩⅤ、附錄158.

[7]陳懷俠，杜 鵬.東莨菪堿及其大鼠肝勻漿代謝物的液相色譜-質(zhì)譜法分析[J].中草藥，2009，40（5）：719.

Study on the Stability of Potassium Dehydroandrographolide Succinate in Vitro

WANG Peng，JIANG Yun-ou（West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）
WANG Peng，JIANG Yun-ou，ZHANG Zhi-yong（Dept.of Pharmacy，West China Hospital of Sichuan University，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To investigate the stability of Potassium Dehydroandrographolide Succinate（PDS）in vitro in different pH and enzymatic solutions.METHODS：PDS was dissolved in different phosphate buffer solutions with pH of 2.0～9.0，stimulated intestinal fluid and liver homogenate of SD rats，thermostatically maintained at 37℃.The concentrations of PDS were determined by HPLC to investigate the degradation kinetics and stability of PDS.RESULTS：PDS was degraded in acid solution（pH 2.0～5.0）immediately（more than 90%PDS was degraded after 1 h of incubation），stable in phosphoric solution（pH 7.0）and stimulated intestinal fluid.The contents of PDS at different sampling points were more than 95%in 2 h.After 24 h of incubation at 37℃，23%PDS was degraded in 50%liver homogenate and 15%in 25%liver homogenate.The degradation speed up as the concentration of liver homogenate increased.CONCLUSION：PDS is instable in solution with pH＜5.0 and liver homogenate（pH 7.0）.The hepatomicrosome enzyme possesses effect on the stability of PDS while pancreatic enzymes is not.

Potassium Dehydroandrographolide Succinate（PDS）；Liver homogenate；Acid-based degradation；Enzymatic degradation

R285；R97

A

1001-0408（2010）39-3664-03

2009-11-09

2010-03-12）