塑料增塑劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活、生長(zhǎng)和免疫的影響

王興強(qiáng)，曹梅，閻斌倫，馬甡

1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港222005

2.中國(guó)海洋大學(xué) 教育部海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266003

塑料增塑劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活、生長(zhǎng)和免疫的影響

王興強(qiáng)1，*，曹梅1，閻斌倫1，馬甡2

1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港222005

2.中國(guó)海洋大學(xué) 教育部海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266003

研究了塑料增塑劑鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）存活、生長(zhǎng)和免疫的影響.96h急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，在助溶劑Tween 20的安全濃度范圍內(nèi)，隨著DMP、DEP、DBP和DOP水平的升高，凡納濱對(duì)蝦存活率呈下降趨勢(shì)，24h、48h、72h和 96h的 LC50分別為 40.33、35.29、25.48、19.14mg·L-1，30.52、23.45、16.96、15.38mg·L-1，7.51、6.97、6.57、6.06mg·L-1和6.85、5.87、5.01、4.47mg·L-1；DMP、DEP、DBP和DOP對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全濃度隨塑料增塑劑碳鏈的增加呈下降趨勢(shì)，分別為8.11、4.15、1.80和1.29mg·L-1.90d慢性毒性實(shí)驗(yàn)表明，凡納濱對(duì)蝦存活率、特定生長(zhǎng)率、血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性均以對(duì)照組和0.0400mg·L-1助溶劑Tween 20處理組最高，而且顯著高于1/100倍DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（p＜0.05）.

凡納濱對(duì)蝦；塑料增塑劑；存活；生長(zhǎng)；免疫

Received 27 February 2009 accepted 18 March 2009

Abstract：The experiments were designed to determine the effects of plastic plasticizers on survival,growth and immune factors of Litopenaeus vannamei.The four commonly used plasticizers were dimethyl phthalate（DMP）,diethyl phthalate（DEP）,di-n-butyl phthalate（DBP）and dioctyl phthalate（DOP）.The result of acute toxicity test for 96h indicated that the survival rate of Litopenaeus vannamei exhibited decreased trend with increasing DMP,DEP,DBP and DOP levels within the safety concentration of co-solvent Tween 20,and LC50at 24h,48h,72h and 96h were 40.33,35.29,25.48 and 19.14mg·L-1;30.52,23.45,16.96 and 15.38mg·L-1;7.51,6.97,6.57 and 6.06mg·L-1;6.85、5.87,5.01 and 4.47mg·L-1,respectively.The safety concentration of DMP,DEP,DBP and DOP decreased with increasing carbon chain,and were 8.11,4.15,1.80 and 1.29mg·L-1,respectively.The result of chronic toxicity test for 90d indicated that the survival rate, specific growth rate,serum protein content,polyphenol oxidase activity and superoxide dismutase activity were high in the control and 0.0400mg·L-1co-solvent Tween 20 treatment,which were significantly higher than the treatments of 1/100 safety concentration of DMP,DEP,DBP and DOP.

Keywords：Litopenaeus vannamei；plastic plasticizer;survival；growth；immune factors

1 引言（Introduction）

鄰苯二甲酸酯類化合物（Phthalic Acid Easters，PAEs）又稱酞酸酯，其中有8種在工業(yè)上用作增塑劑，以增加塑料及橡膠制品的可塑性.在塑料中，PAEs與聚烯烴類塑料分子之間由氫鍵或范德華力連接，彼此保留各自相對(duì)獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì)，隨著時(shí)間的推移，可由塑料中遷移到外環(huán)境，造成對(duì)空氣、水和土壤的污染（Ching et al.,1981）.有關(guān)PAEs對(duì)水生生物毒性的研究，國(guó)內(nèi)外已有比較多的報(bào)道，但主要集中于PAEs對(duì)浮游動(dòng)物、魚類等敏感生物的生長(zhǎng)、繁殖等生理功能的影響，對(duì)蝦類的報(bào)道相對(duì)較少（Vivian,1986;Warren et al., 2003;Horn et al.,2004）.塑料制品在對(duì)蝦養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，如在苗種生產(chǎn)上常用塑料薄膜纏裹培育池中的加熱管道，在苗種和養(yǎng)殖生產(chǎn)上常用塑料管道輸水等.塑料制品在高溫條件下可產(chǎn)生有毒物質(zhì)，對(duì)對(duì)蝦危害很大.馬甡等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，在水中加熱塑料薄膜后水中的化學(xué)需氧量顯著上升，推測(cè)可能與有大量惡化化學(xué)物質(zhì)溶出有關(guān).凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)重要種類之一，但近年來，由于水質(zhì)污染，其種質(zhì)出現(xiàn)退化，疾病流行，對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)損失重大.鑒于此，本文探討了幾種常用塑料增塑劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活、生長(zhǎng)和免疫的影響.

2 材料與方法（Materials and methods）

實(shí)驗(yàn)于2008年5月至11月份在江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行.凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei），平均濕體重（0.625±0.386）g，購(gòu)自贛榆縣海洋源育苗廠.對(duì)蝦在一個(gè)玻璃纖維水槽（200cm×200cm×100cm）中暫養(yǎng)，水溫23.5～25.0℃，鹽度31.

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，助溶劑Tween 20、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）設(shè)計(jì)梯度見表1.每個(gè)水族箱（30cm× 40cm×50cm，養(yǎng)殖水體50L）放養(yǎng)5尾對(duì)蝦，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，鹽度31，水溫（25.0±0.1）℃，實(shí)驗(yàn)周期96h.

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)濃度梯度Table 1 Concentration gradient of acute experiment

2.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

在急性毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，分別為鹽度31海水對(duì)照組、0.0400mg·L-1助溶劑 Tween 20處理組、1/100倍塑料增塑劑 DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（1/100 DMP處理組：1/100倍 DMP安全濃度+0.0400mg·L-1Tween 20，即0.0811mg·L-1DMP+0.0400mg·L-1Tween 20；1/100 DEP、1/100 DBP和1/100 DOP處理組同 DMP處理，即 0.0415mg·L-1DEP+ 0.0400mg·L-1Tween20、0.0180mg·L-1DBP+ 0.0400mg·L-1Tween 20、0.0129mg·L-1DOP+ 0.0400mg·L-1Tween 20），每個(gè)水族箱（30cm× 40cm×50cm，養(yǎng)殖水體50L）放養(yǎng)5尾對(duì)蝦，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù).

實(shí)驗(yàn)前停食24h，用電子天平稱其初始體重.飼料為福建馬尾生產(chǎn)的“海馬”牌人工配合飼料，其粗蛋白、脂肪、灰分和含水量分別為（38.07± 0.37）%、（9.81±0.24）%、（12.21±0.32）%和（4.45± 0.57）%.日投餌兩次（06：00和18：00），過量投餌；投餌2.5h后從每個(gè)水族箱收集殘餌和糞便.為維持實(shí)驗(yàn)期間水族箱內(nèi)所設(shè)塑料增塑劑濃度的穩(wěn)定性，每隔3d，水族箱徹底換水一次，實(shí)驗(yàn)周期90d.實(shí)驗(yàn)期間，鹽度保持在31，溶解氧6.0mg·L-1以上，pH 7.7～8.2，水溫（25.0±0.1）℃.

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)每個(gè)水族箱中的凡納濱對(duì)蝦再次進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重；每個(gè)水族箱取3～5尾對(duì)蝦，取血時(shí)用1mL無菌注射器，按照血淋巴與抗凝劑（0.01mol·L-1Tris-HCl，0.25mol·L-1蔗糖，0.1mol·L-1檸檬酸三鈉；pH 7.6；780mOs·kg-1）1：2的比例，自對(duì)蝦頭胸甲后插入心臟抽取血液，合并置于無菌Eppendorf管.所取抗凝血，一部分離心10min（700×g，4℃）（MIKR022R，德國(guó)HEYYICH公司），所得的上清液一部分用于血清酚氧化酶（PO）活力的測(cè)定，另一部分于-20℃冰箱中保存，用于血清蛋白含量和超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定.

2.3 免疫指標(biāo)的測(cè)定

2.3.1 血清蛋白含量

應(yīng)用總蛋白定量測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)），反應(yīng)于96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)量各反應(yīng)體在595nm波長(zhǎng)下OD值.

2.3.2 PO活力的測(cè)定

以L-DOPA為底物，采用改進(jìn)的Ashida方法（雷質(zhì)文等，2001;Ashida,1971）在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行.把10μL血清加入96孔酶標(biāo)板中，然后向各孔中加入 200μL 0.1mol·L-1pH 6.0磷酸鹽緩沖液，最后向各孔中加入10 μl的L-DOPA（Sigma公司）（0.01 molμL-1）在酶標(biāo)儀（BIO-TEKSYNERGE，美國(guó)Bio公司）中振蕩4次，每隔4min讀取490nm處的吸光值，酶活力以試驗(yàn)條件下，OD490每分鐘增加0.001為一個(gè)酶活力單位.

2.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定

應(yīng)用超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)），反應(yīng)于96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)量各反應(yīng)體在550nm波長(zhǎng)下OD值.

2.4 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算

所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析、Turkey’s多重比較，以p＜0.05作為差異顯著水平.安全濃度（Sc）以下式計(jì)算：

式中：LC50為半致死濃度.特定生長(zhǎng)率（SGR）的計(jì)算公式為：

式中W1和W2分別為凡納濱對(duì)蝦的初體重和末體重（濕重）；t為實(shí)驗(yàn)周期.

3 結(jié)果與分析（Results and analysis）

3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

Tween 20是一種非離子表面活性劑，因?yàn)镻AEs在水中的溶解度很小，利用表面活性劑的兩親性性質(zhì)和乳化作用，增大PAEs在水中的溶解度.張春榮等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，適量的Tween 20有利于提高細(xì)胞某些酶的穩(wěn)定性和催化能力，但高濃度的Tween 20可抑制細(xì)胞的活力.由表2可以看出，隨著Tween 20水平的升高，凡納濱對(duì)蝦存活率呈下降趨勢(shì)；在24h、48h、72h和96h，LC50分別為129.62、110.08、80.47、70.21mg·L-1，安全濃度為23.82mg·L-1，表明Tween 20對(duì)凡納濱對(duì)蝦有一定的毒性.

表2 Tween 20對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 2 The effect of Tween 20 on survival of Litopenaeus vanname（iMean±SD）

由表3～表6可以看出，在助溶劑Tween 20的安全濃度范圍內(nèi)，隨著DMP、DEP、DBP和DOP水平的升高，凡納濱對(duì)蝦存活率呈下降趨勢(shì)，24h、 48h、72h和96h的LC50分別為40.33、35.29、25.48、19.14mg·L-1，30.52、23.45、16.96、15.38mg·L-1，7.51、6.97、6.57、6.06mg·L-1和 6.85、5.87、5.01、4.47mg·L-1；安全濃度分別為 8.11、4.15、1.80和1.29mg·L-1，表明隨碳鏈的增加，塑料增塑劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性呈增大趨勢(shì).與本研究相似，Call等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，DMP、DEP和 DBP對(duì) Hyalella azteca的LC50分別為28.1、4.21和0.63mg·L-1，而對(duì)Chironomus tentans的LC50分別為68.2、31.0和2.64mg·L-1，與本研究結(jié)果具有可比性.

表3 鄰苯二甲酸二甲酯對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 3 The effect of dimethyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

表4 鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 4 The effect of diethyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

表5 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 5 The effect of di-n-butyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

表6 鄰苯二甲酸二辛酯對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率的影響（Mean±SD）Table 6 The effect of dioctyl phthalate on survival of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

3.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

據(jù)2000年的一項(xiàng)調(diào)查顯示，國(guó)外的海洋表層水和淡水中PAEs含量在0.1～300.0 μg·L-1之間，我國(guó)大的江河湖泊、水庫、飲用水、大氣、土壤底泥中也均不同程度地檢出PAEs（Warren et al.,2003; Vivian,1986）.PAEs易溶于脂肪和有機(jī)溶劑，有較強(qiáng)的生物富集作用和一定強(qiáng)度的抗降解能力，而某些水生物對(duì)PAEs有驚人的濃縮作用.例如，蝦在含鄰苯二甲酸二異辛酯0.11μg·L-1的水中生活兩周后，體內(nèi)鄰苯二甲酸二異辛酯的含量可高達(dá)1.34mg·L-1，濃縮了大約12000倍；水體幼蟲在濃度為0.18μg·L-1的DBP中暴露7d后，體內(nèi)DBP濃縮了大約 6000倍（Sung et al.,2003;Defoe et al.,1990）；李瀟等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，DBP在珠江三角洲地區(qū)鯽魚、草魚和羅非魚3種魚類體內(nèi)的含量在3～10mg·kg-1之間.生物富集是造成慢性毒害、引起器質(zhì)性病變和影響生理機(jī)能的重要因素（李學(xué)彬等，2008;Thurén and Woin,1991）.在含鄰苯二甲酸二異辛酯劑量為3、10和30μg·L-1的水體中，大型蚤在兩周內(nèi)的繁殖量比正常情況分別減少60%、70%和80%（戰(zhàn)宇明，2004）.本研究中，經(jīng)過90d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：凡納濱對(duì)蝦存活率和特定生長(zhǎng)率以對(duì)照組和0.0400mg·L-1助溶劑Tween 20處理組最高，而且顯著高于 1/100倍 DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（p＜0.05；表7）.同樣，林玲等（2008）研究了DBP對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的影響，發(fā)現(xiàn)625μg·L-1以上劑量的DBP染毒能導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩.如果這些有害物質(zhì)，通過生物的吸收，并由食物鏈進(jìn)一步傳遞和富集，最終將會(huì)影響到人類健康.

PAEs還會(huì)影響水生生物的免疫系統(tǒng)（Chen and Sung,2004）.李文英等（2007）等對(duì)數(shù)濃度差設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度0.38、0.85、1.90和4.25mg·L-1進(jìn)行20d慢性染毒，發(fā)現(xiàn)隨DBP濃度增大和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，斑馬魚肝臟、鰓中SOD和ATPase活性均顯著受到抑制.血清蛋白含量、PO、SOD等是表征對(duì)蝦免疫狀態(tài)的重要指標(biāo).對(duì)蝦生活在一個(gè)具有潛在危害的水體環(huán)境中，由于其尚不具備特異性的免疫系統(tǒng)，為保護(hù)自身免受傷害，機(jī)體形成了各種非特異性的免疫保護(hù)體系，但是當(dāng)環(huán)境劇烈變化時(shí)，免疫系統(tǒng)崩潰，會(huì)造成對(duì)蝦大規(guī)模死亡.已有許多研究表明，在環(huán)境脅迫條件下，對(duì)蝦的血細(xì)胞數(shù)量減少，與抗病力有關(guān)的酶活力降低，對(duì)病原體的易感性提高（Chen and Chang,1993; Perazzolo et al.,2002）.90d的慢性毒理實(shí)驗(yàn)表明，凡納濱對(duì)蝦血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性均以對(duì)照組和0.0400mg·L-1助溶劑Tween 20處理組最高，而且顯著高于1/100倍DMP、DEP、DBP和DOP安全濃度處理組（p＜0.05）（圖1～圖3）.這可能是由于對(duì)蝦處于應(yīng)激狀態(tài)，一方面需要消耗對(duì)蝦體內(nèi)的免疫因子，從而導(dǎo)致免疫因子活力下降，血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性降低；另一方面對(duì)蝦生理機(jī)能失調(diào)，從而使得蝦體對(duì)病原菌的易感性提高，對(duì)蝦存活率降低，生長(zhǎng)速度減緩.

表7 塑料增塑劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活和生長(zhǎng)的影響（Mean±SD）Table 7 The effect of plastic plasticizer on survival and growth of Litopenaeus vannamei（Mean±SD）

綜合以上研究得到如下結(jié)論：

1）在助溶劑Tween 20的安全濃度范圍內(nèi)，隨著DMP、DEP、DBP和DOP水平的升高，凡納濱對(duì)蝦存活率呈下降趨勢(shì)；隨碳鏈的增加，塑料增塑劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦的急性毒性呈增大趨勢(shì).

2）凡納濱對(duì)蝦長(zhǎng)期處于DMP、DEP、DBP和DOP低濃度條件下，可導(dǎo)致對(duì)蝦處于應(yīng)激狀態(tài)，一方面需要消耗對(duì)蝦體內(nèi)的免疫因子，從而導(dǎo)致免疫因子活力下降，血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性降低；另一方面對(duì)蝦生理機(jī)能失調(diào)，從而使得蝦體對(duì)病原菌的易感性提高，對(duì)蝦存活率降低，生長(zhǎng)速度減緩.

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EffectsofPlasticPlasticizersonSurvival,Growth and Immune Factors of Litopenaeus vannamei

WANG Xing-qiang1，*，CAO Mei1，YAN Bin-lun1，MA Shen2
1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005
2.Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003

1673-5897（2010）1-069-07

X174，S968.22

A

王興強(qiáng)（1975—），男，博士，副教授，主要從事水生動(dòng)物生理生態(tài)研究.

2009-02-27 錄用日期：2009-03-18

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（No.2006BAD09A01;No.2006BAD09A06）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.BK2006548）；江蘇省教育廳“青藍(lán)工程”項(xiàng)目（No.QN07008）

王興強(qiáng)（1975—），男，副教授，博士；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:xqwangcaomei@yahoo.com.cn