桃果實酰基輔酶A氧化酶活性檢測方法的建立

劉巍立，賈惠娟，張 鑫

(浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 園藝系，浙江 杭州 310029)

?；o酶A氧化酶 (ACOX)，亦稱脂酰基輔酶 A氧化酶。1969年，由 Cooper等［1］在蓖麻子胚乳中首次發(fā)現(xiàn)，然后陸續(xù)在大鼠肝臟［2］、四膜蟲［3］、酵母菌［4］以及黃瓜苗子葉組織［5］、南瓜子葉組織［6］、西紅柿［7］上報道。

ACOX屬氧化還原酶，專一作用于CH—CH基團(tuán)，同時以O(shè)2作為受體，參與各類脂酸β－氧化的第一步反應(yīng)［8］，也是酵母菌中 γ－癸內(nèi)酯合成的關(guān)鍵酶［9－10］。自發(fā)現(xiàn)以來，有多種活性測定方法問世。目前，植物中ACOX活性測定多采用Tris－HCl緩沖液萃取法［5－7，11］，大鼠肝臟和酵母菌中采用磷酸鉀緩沖液 (KPB)萃取法［2，4］，反應(yīng)體系最適pH 和溫度 隨 組 織 不 同 而 不 同［2，5－7，9，11］， 但 有 關(guān) 果實組織中的活性測定方法尚未見報道。

水蜜桃的香氣物質(zhì)是衡量桃果實品質(zhì)的重要指標(biāo)。成熟桃果實特征香氣物質(zhì)主要是“果香型”物質(zhì) γ－、δ－內(nèi)酯類［12－17］，約占成熟果實總香氣的97% 左右［15，18］，主要由 β－氧化途徑合成而來［12，19］，ACOX是β－氧化降解代謝的限速酶［8］。因此篩選果實組織中的ACOX活性測定體系是研究果實香氣合成過程中ACOX功能的基礎(chǔ)。本文以湖景蜜露水蜜桃果實為材料，測定了pH 6.5～8.5，溫度20～40℃范圍內(nèi)果肉部分ACOX的活性變化，結(jié)合不同的萃取方法，建立果實組織中ACOX活性的穩(wěn)定檢測體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湖景蜜露 (Prunus persicaL.)水蜜桃果實試材采自浙江嘉興鳳橋的經(jīng)濟(jì)果園，樹齡7年，常規(guī)田間管理，實驗取樣時果實的成熟度為生理成熟期［20］，采摘后立即運(yùn)至實驗室，選擇大小均勻、無機(jī)械損傷的新鮮果實，置于恒溫箱中，20℃貯藏3 d，果實達(dá)到完熟，取果肉保存至－75℃。

1.2 儀器及試劑

測活所用棕櫚酰輔酶A、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及辣根過氧化物酶 (HRP)均為Sigma產(chǎn)品，安替比林與苯酚為國產(chǎn)試劑，其它化學(xué)試劑均為分析純。主要儀器有德國 Eppendorf centrifuge 5810R離心機(jī)、美國 Beckman UV800紫外/可見分光光度計和T25 basic ULTRA－TURRAX攪拌儀。

1.3 酶活性測定方法

以Allain等［21］方法為基礎(chǔ)加以改進(jìn)，簡化操作步驟，縮減反應(yīng)體積。

1.4 酶活性測定原理

ACOX催化?；o酶A在β位氧化，形成烯并釋放過氧化氫。隨后在顯色反應(yīng)中，過氧化氫與安替比林、苯酚在過氧化物酶催化下，生成顯色產(chǎn)物醌亞胺。測定A500可計算ACOX催化反應(yīng)中過氧化氫的生成量。

1.5 酶活性檢測體系

1.5.1 酶粗液的萃取方法

據(jù)文獻(xiàn)報道，ACOX有2種萃取方法 (表1)，即使用Tris－HCl緩沖液和磷酸鉀緩沖液 (KPB)2種緩沖液。本實驗使用該2種緩沖液進(jìn)行酶活性檢測條件探索。

方法1為磷酸鉀緩沖液萃取法 (KPB萃取法)。取5 g果肉組織，液氮研磨成粉末狀，加入不同梯度pH的磷酸鉀緩沖液8 mL，充分混勻，4℃，10 000g，離心5 min，取上清液，用于 ACOX酶活性測定。

表1 ACOX的萃取方法

方法 2為 Tris－HCl緩沖液萃取法 (Tris－HCl萃取法)。整個實驗在4℃環(huán)境中進(jìn)行。取5 g果肉組織，加入液氮研磨，加入25 mL丙酮(－20℃)充分混勻，12 000g離心30 min，去除上清液，沉淀加入 25 mL Tris緩沖液［150 mmol Tris－HCl(不同梯度 pH)，10 mmol KCl，1 mmol EDTA，25%(m/V)蔗糖］溶解，然后高速攪拌使其混合均勻，用紗布過濾去除雜質(zhì)，濾液經(jīng)12 000g離心30 min，取上清液水浴50℃加熱5 min，冰浴冷卻至2℃，12 000g離心30 min，取上清液用于 ACOX酶活性測定。

1.5.2 pH對酶活性測定的影響

配置pH值為6.5～8.5(梯度為0.5)磷酸鉀緩沖液、Tris－鹽酸緩沖液，比較兩種萃取法不同pH對酶活性測定的影響，確定最適pH。

1.5.3 溫度對酶活性的影響

采用1.5.2中最適 pH，測定溫度20～40℃(梯度為5℃)下的酶活性，確定最適溫度。

1.5.4 反應(yīng)體系

70 μL反應(yīng)體系中含有 1 μL底物液－棕櫚酰輔酶 A(0.1 mmol·L－1)，1 μL 苯 酚 溶 液 (1.06 mol·L－1)，34 μL 顯色液 (60 U·mL－1辣根過氧化 物 酶，1.64 mmol·L－1安 替 比 林，20 μ mol·L－1FAD)，34 μL 提取的粗酶液。1 μL 底物液，1 μL苯酚溶液，34 μL顯色液加入比色杯，20～40℃ (梯度為5℃)恒溫5 min，加入34 μL粗酶液，每隔15 s記錄1次D值變化，共測定5 min，以1～2 minD值變化計算酶活性。酶活性以ΔD500·g－1·min－1表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對酶活性測定的影響

圖1為不同pH條件下，2種萃取方法粗酶液測定的吸光度值變化，隨著時間的變化，吸光度逐漸升高，2 min左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。圖2為不同pH條件下，不同萃取方法ACOX活性變化，2種萃取方法都在pH值7.5時，酶活性達(dá)到最大，分別為0.126 和 0.168 ΔD500·g－1·min－1，pH 偏高或偏低酶活性都有明顯下降。由此表明緩沖液pH對ACOX活性的測定結(jié)果有顯著影響。

圖1 不同萃取方法粗酶液測定的吸光度值變化

2.2 溫度對酶活性測定的影響

圖3顯示，Tris－HCl 萃取法中，ACOX活性在30℃時達(dá)到最大，溫度過高過低，活性都會下降;KPB萃取法中，最適溫度為25℃，但25～35℃范圍內(nèi)活性變化不大。

2.3 萃取方法對酶活性測定的影響

盡管緩沖液的濃度和pH值相同，但緩沖液的類型對ACOX活性測定結(jié)果也會有明顯影響。如表2所示，2種萃取方法的酶活性測定結(jié)果有顯著差異。Tris－HCl萃取法測得的ACOX活性顯著高于KPB萃取法，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)均小于KPB萃取法，說明Tris－HCl萃取法能更有效地提取桃果實中的ACOX，并且實驗誤差小，精度高。

圖2 pH對桃果實中ACOX活性測定的影響

圖3 溫度對桃果實中ACOX活性測定的影響

表2 不同萃取方法的ACOX活性

3 討論

影響酶活性測定結(jié)果的因素主要有緩沖液、pH和溫度。酶學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)體系的pH值對酶生物催化活性至關(guān)重要。強(qiáng)酸或強(qiáng)堿都會影響酶的構(gòu)象，或改變酶與底物分子的結(jié)合、分離動態(tài)，或使酶變形甚至失活，從而影響酶的活力［22］。研究表明，不同植物、不同組織中的ACOX活性測定的最適pH值不盡相同。黃瓜苗子葉組織活性測定的最適 pH 為 7.5［5］，南瓜子葉組織為 7.8［6］，西紅柿為 8.0［7］，火炬松雌配子體為 7.5［11］，酵母菌和大鼠肝臟組織分別為 7.5［4］和 7.4［2］。本實驗測得最適pH為7.5。

溫度升高能加快酶反應(yīng)速度，但溫度過高也會破壞酶穩(wěn)定構(gòu)型，疏水殘基如色氨酸、苯丙氨酸等外露而失去催化活性［23］。本實驗發(fā)現(xiàn)，采用30℃溫度測定，體系穩(wěn)定，精確度高。這與文獻(xiàn)中微生物和高等植物?；o酶A氧化酶最適測定溫度大多為30℃相一致。

另一方面，萃取的緩沖液不同，所攜帶的無機(jī)離子不同，也可能最終影響萃取的結(jié)果和活性的測定。研究報道酵母菌中ACOX萃取多采用KPB萃取法，因其組織結(jié)構(gòu)簡單，通過磷酸鹽緩沖液粗提即可獲得較高的酶活性，而桃實結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有糖類、酚類等雜質(zhì)物質(zhì)，對ACOX萃取產(chǎn)生了很大的影響。由于Tris－HCl萃取法經(jīng)過了粗提取、熱處理和沉淀處理，使酶活性顯著提高，而且反應(yīng)迅速穩(wěn)定。這與文獻(xiàn)中植物組織中 ACOX多采用Tris－HCl萃取法結(jié)論一致。

4 小結(jié)

本實驗在文獻(xiàn)報道方法的基礎(chǔ)上，確立了一個適合桃果實ACOX活性檢測的體系:整個實驗在4℃環(huán)境中進(jìn)行。取5 g果肉組織，加入液氮研磨，再加入25 mL丙酮 (－20℃)充分混勻，12 000g離心30 min，去除上清液，沉淀加入25 mL Tris緩沖液 (pH 7.5)［150 mmol Tris－HCl，10 mmol KCl，1 mmol EDTA，25%(m/V)蔗糖］溶解，然后高速攪拌使其混合均勻，紗布過濾去除雜質(zhì)，濾液經(jīng)12 000g離心30 min，取上清液水浴50℃加熱5 min，冰浴冷卻至2℃，12 000g離心30 min，上清液用于ACOX活性的測定。70 μL反應(yīng)體系中含有1 μL底物液－棕櫚酰輔酶 A，1 μL苯酚溶液(1.06 mol·L－1)，34 μL 顯色液 (60 U·mL－1辣根過氧化物酶，1.64 mmol·L－1安替比林，20 μmol·L－1FAD)，34 μL 提取的粗酶液。1 μL 底物液，1 μL苯酚溶液，34 μL顯色液加入比色杯，30℃恒溫5 min，加入34 μL粗酶液，每隔15 s記錄1次D值變化，共測定5 min，以1～2 minD值變化計算酶活性，酶活性以 ΔD500·g－1·min－1表示。

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