不補(bǔ)料連續(xù)酶解-膜分離耦合制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的研究

馬海樂，王中斌，駱 琳，何榮海

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇鎮(zhèn)江212013)

不補(bǔ)料連續(xù)酶解-膜分離耦合制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的研究

馬海樂1，2，王中斌1，駱 琳1，2，何榮海1，2

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇鎮(zhèn)江212013)

以克服傳統(tǒng)酶解技術(shù)存在的不足，提高酶解反應(yīng)效率為目的，研究了魚鱗膠原蛋白抗氧化肽制備的不補(bǔ)料連續(xù)酶解－膜分離耦合反應(yīng)技術(shù)。從實(shí)驗(yàn)得到的加酶量、底物濃度和循環(huán)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響規(guī)律分析了酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的酶解技術(shù)的原因。通過正交實(shí)驗(yàn)，得到最優(yōu)的酶解工藝條件為:底物濃度4%(W/W)、加酶量1.5%、反應(yīng)時(shí)間30min、反應(yīng)溫度60℃、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速120r/min和pH9.5，該條件下蛋白轉(zhuǎn)化率高達(dá)97.56%。

酶膜耦合，魚鱗膠原蛋白，抗氧化肽，蛋白轉(zhuǎn)化率

Abstract:To overcome disadvantage of conditional enzymatic hydrolysis and improve reaction effect，continuous coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation without material(CEHMS)feeding was used for preparation of antioxidant peptides from scale collagen.The reason why CEHMS was better than conditional enzymatic hydrolysis was analyzed from effectual rules of enzymatic dosage，substrate concentration and cycle pump speed on percent conversion of protein.The optimal conditions gotten from orthogonal test were:substrate concentration 4%(W/W)，enzymatic dosage1.5%，reaction time 30min，reaction temperature 60℃，cycle pump speed 120r/min and pH9.5.Under the optimal conditions，percent conversion of protein reached 97.56%.

Key words:coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation;scale collagen;antioxidant peptides;percent conversion of protein

近年來國內(nèi)外關(guān)于魚鱗膠原蛋白利用的研究主要集中在提取技術(shù)方面［1－3］，經(jīng)過酶解轉(zhuǎn)化成為功能多肽的報(bào)道尚較為鮮見。曾少葵［4］、涂宗財(cái)［5］等人研究了魚鱗膠原蛋白酶解技術(shù)，研究表明酶解產(chǎn)物具有顯著的抗氧化活性。但是實(shí)踐證明，采用傳統(tǒng)的酶解技術(shù)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)物抑制效應(yīng)和多肽過度降解等問題。近年大量的研究證明，酶解－膜分離耦合技術(shù)可以克服傳統(tǒng)酶解技術(shù)存在的不足，顯著提高酶解反應(yīng)效率和產(chǎn)物的活性［6－9］。為此，本課題組將酶解－膜分離耦合技術(shù)應(yīng)用于魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的制備，本文重點(diǎn)研究在不補(bǔ)料的情況下，底物濃度、加酶量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速等因素對(duì)酶解制備抗氧化肽效果的影響。在此工作的基礎(chǔ)上，下一步課題組將研究連續(xù)補(bǔ)料的工作情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚鱗膠原蛋白 市售;濃硫酸 國產(chǎn)分析純;Alcalase 2.4L 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。

Pellicon小型超濾系統(tǒng) 包括截留分子量為3kDa的纖維素平板膜，美國Millipore公司;PHS－3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;AvantiJ－25高效離心機(jī) 美國貝克曼公司;凱氏定氮儀 常州誠和儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定與轉(zhuǎn)化率的計(jì)算 蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法(GB/T5009.3－2003)。蛋白轉(zhuǎn)化率以膜過濾透過液中蛋白質(zhì)含量占原料液中蛋白質(zhì)含量百分比計(jì)算:

式中:X為蛋白轉(zhuǎn)化率，%;C0為原料液蛋白含量，mg/mL;V0為原料液總體積，mL;C1為透過液蛋白含量，mg/mL;V1為透過液總體積，mL。

1.2.2 不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)操作的基本流程一定底物濃度的魚鱗膠原蛋白溶液→調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH、反應(yīng)溫度→超濾泵轉(zhuǎn)速100r/min循環(huán)5min→加酶→進(jìn)行酶解－膜分離耦合反應(yīng)一定時(shí)間→收集透過液→測(cè)定底物蛋白轉(zhuǎn)化率

1.2.3 不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn) 以Alcalase為反應(yīng)用蛋白酶，采用截留分子量為3kDa的纖維素平板膜，在不補(bǔ)充料液的情況下，對(duì)魚鱗膠原蛋白進(jìn)行連續(xù)循環(huán)的酶解－膜分離耦合反應(yīng)。在Alcalase推薦的酶解溫度和pH下，考察酶解反應(yīng)時(shí)間、底物濃度、加酶量、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速對(duì)魚鱗膠原蛋白轉(zhuǎn)化率的影響，確定最佳酶解工藝。截留分子量3kDa的多肽由前期酶解產(chǎn)物的抗氧化實(shí)驗(yàn)篩選所得。

各單因素的取值分別為:反應(yīng)時(shí)間10、20、30、40、50、60min，加酶量 0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%，反應(yīng)溫度 45、50、55、60℃，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速 50、100、150r/min，底物濃度0.5%、1%、2%、3%、4%。其實(shí)在一般的酶解反應(yīng)中，反應(yīng)的溫度和pH使用蛋白酶的推薦值即可，但是酶膜耦合反應(yīng)考慮到外循環(huán)可能會(huì)引起系統(tǒng)實(shí)際溫度發(fā)生變化，因此有必要研究料液溫度的影響。

1.2.4 不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以底物蛋白轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，以加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)液pH、反應(yīng)時(shí)間、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速和底物濃度為實(shí)驗(yàn)因素，通過六因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)［11］(如表1所示)，優(yōu)化確定不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)制備抗氧化肽的最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響 酶膜耦合反應(yīng)條件:加酶量3%，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)液pH9.0，底物濃度1.5%，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100r/min。反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，魚鱗膠原蛋白轉(zhuǎn)化率提高迅速，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間高于40min時(shí)，魚鱗膠原蛋白的轉(zhuǎn)化率提升幅度趨于平緩。反應(yīng)初期轉(zhuǎn)化率提高迅速的原因一方面是由于底物相對(duì)酶量而言比較充分;另一方面由于大分子底物蛋白的不斷伸展，肽鏈的解聚，有利于底物與蛋白酶的充分接觸、降解過程的進(jìn)行。到了反應(yīng)后期，底物逐漸不足，受酶催化蛋白質(zhì)的解聚過程趨于結(jié)束，已經(jīng)伸展的大分子蛋白大部分被蛋白酶催化降解，因此蛋白轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定。

2.1.2 加酶量對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響 酶膜耦合反應(yīng)條件:反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)液pH9.0，底物濃度1.5%，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100r/min。不同加酶量下蛋白轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化的曲線如圖2所示。

圖1 酶膜耦合反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響

圖2 不同加酶量對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可知，在相同的反應(yīng)時(shí)間下，當(dāng)加酶量小于1.5%時(shí)，底物蛋白轉(zhuǎn)化率隨加酶量的增加而提升較快，當(dāng)加酶量高于1.5%時(shí)蛋白轉(zhuǎn)化率的增加不明顯，其直接的原因是此時(shí)底物蛋白已經(jīng)被蛋白酶所飽和。低酶量下轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間增加而增加的速率緩于加酶量高的情況，但超過線性增加階段的末端以后，低酶量對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化率還持續(xù)以一個(gè)較高的速度增加，這個(gè)結(jié)果可能與采用酶膜耦合反應(yīng)有一定的關(guān)系。酶膜耦合反應(yīng)可以在酶解的同時(shí)持續(xù)不斷地將小分子的多肽分離出去，對(duì)于低酶量的情況，相對(duì)于傳統(tǒng)的酶解方法，有利于緩解酶量不足的現(xiàn)象，將蛋白酶繼續(xù)高效地用于殘存的可以被酶解的蛋白質(zhì)。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響 酶膜耦合反應(yīng)條件:加酶量 1.5%，反應(yīng)液 pH9.0，底物濃度1.5%，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100r/min。不同反應(yīng)溫度下蛋白轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化的曲線如圖3所示。

圖3 不同反應(yīng)溫度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可知，在不同的反應(yīng)溫度下，蛋白轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。蛋白轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高，先增加后減小，55℃時(shí)達(dá)到最大。而這與堿性蛋白酶推薦的最佳溫度50℃相差5℃，這主要是因?yàn)?，推薦的溫度是在未使用膜過濾情況下的最適溫度，而使用了酶膜耦合反應(yīng)方案后，料液通過管道到達(dá)膜裝置，在料液輸送過程中存在一定的熱量損失，需要予以補(bǔ)充。因此選擇55℃為后續(xù)實(shí)驗(yàn)溫度。

2.1.4 底物濃度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響 酶膜耦合反應(yīng)條件:加酶量1.5%，反應(yīng)液pH9.0，反應(yīng)溫度55℃，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100r/min。不同底物濃度下蛋白轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化的曲線如圖4所示。

圖4 不同底物濃度對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響

許學(xué)書的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［10］，對(duì)于傳統(tǒng)的酶解反應(yīng)而言，底物濃度越高反應(yīng)速率越低，許學(xué)書認(rèn)為由于底物抑制所致，其實(shí)高濃度底物會(huì)產(chǎn)生高濃度的產(chǎn)物多肽，高濃度產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的抑制效應(yīng)是降低其反應(yīng)速率的重要原因。由圖4可以看出，在底物濃度達(dá)到3%之前，底物濃度越高，反應(yīng)速率隨時(shí)間的增加上升越快，這個(gè)結(jié)果說明酶膜耦合反應(yīng)很好地消除了產(chǎn)物抑制效應(yīng)。但當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^3%時(shí)，酶解產(chǎn)生的多肽量過多因膜的過濾能力不足，出現(xiàn)了產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)底物濃度選擇3%。

2.1.5 循環(huán)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響 酶膜耦合反應(yīng)條件:加酶量1.5%，反應(yīng)液 pH9.0，反應(yīng)溫度55℃，底物濃度3%。不同循環(huán)泵轉(zhuǎn)速下蛋白轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化的曲線如圖5所示。

由圖5可知，循環(huán)泵的轉(zhuǎn)速高時(shí)，隨著時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率迅速上升，但很快達(dá)到穩(wěn)定階段的轉(zhuǎn)化點(diǎn)，其原因應(yīng)當(dāng)是快速循環(huán)，一方面有利于酶解出來的小分子多肽及時(shí)排出反應(yīng)系統(tǒng)，另一方面液體循環(huán)的強(qiáng)化傳質(zhì)作用有利于促進(jìn)酶與底物的接觸，但20min后底物變得不足，快速的循環(huán)反而變得降低酶與底物的有效接觸。從100r/min這條曲線可以看出，對(duì)于較低的轉(zhuǎn)速，在轉(zhuǎn)化點(diǎn)30min以后，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率還以一定的速度上升，因此說明反應(yīng)后期相對(duì)較低的循環(huán)速度，在不影響多肽排出的情況下，有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)的酶解。圖5的啟示為，對(duì)于不補(bǔ)料的工作模式，采取先高速后低速的變速循環(huán)策略，應(yīng)當(dāng)有利于改善蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。

通過上述單因素實(shí)驗(yàn)，得到較優(yōu)的反應(yīng)條件是:加酶量1.5%，反應(yīng)溫度55℃，底物濃度3%(W/W)，循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100r/min，反應(yīng)時(shí)間40min，從圖5可以看出，該條件下蛋白轉(zhuǎn)化率為92.75%。

圖5 不同循環(huán)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 不補(bǔ)料連續(xù)酶膜耦合反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照表1的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，完成的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如表2所示。

由表2可知，按照極差大小，影響抑制率的五個(gè)因素的主次順序依次為A＞E＞C＞F＞D＞B，即影響酶解液抑制率最大的是底物濃度，其次是反應(yīng)時(shí)間，然后依次是反應(yīng)溫度、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速、反應(yīng)液pH、加酶量。由于最佳組合沒有出現(xiàn)在正交表中，因此對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，該條件下蛋白轉(zhuǎn)化率平均為97.56%，比單因素蛋白轉(zhuǎn)化率提高了5.19%。

3 結(jié)論

3.1 加酶量、底物濃度和循環(huán)泵轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響規(guī)律，證明了酶膜耦合反應(yīng)技術(shù)在克服傳統(tǒng)酶解技術(shù)不足方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)得到較優(yōu)的酶解條件為:底物濃度3%(W/W)、加酶量1.5%、反應(yīng)時(shí)間40min、反應(yīng)溫度55℃、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100r/min，該條件下蛋白轉(zhuǎn)化率為92.75%。

3.3 正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)的酶解工藝條件為:底物濃度4%(W/W)、加酶量1.5%、反應(yīng)時(shí)間30min、反應(yīng)溫度60℃、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速120r/min、pH9.5，該條件下蛋白轉(zhuǎn)化率為97.56%，比單因素實(shí)驗(yàn)得到的蛋白較優(yōu)轉(zhuǎn)化率提高了5.19%。

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表2 L18(37)正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表

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Preparation of antioxidant peptides from scale collagen by continuous coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation without material feeding

MA Hai－le1，2，WANG Zhong－bin1，LUO Lin1，2，HE Rong－h(huán)ai1，2
(1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China;2.Jiangsu Provincial Research Center of Bio－process and Separation Engineering of Agri－products，Zhenjiang 212013，China)

TS201.2+1

B

1002－0306(2010)08－0204－04

2010－05－17

馬海樂(1963－)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:食品分離及食品生物技術(shù)。

863計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA100404);國家十一五支撐計(jì)劃(2006BAD27B06)。