GRP78在肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用

吳晶 王琪 王佳瑞 張黎川 趙龍

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，而且80%的患者確診時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，因此化療在肺癌的治療中具有重要的作用。然而化療耐藥一直是肺癌治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，腫瘤耐藥的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境密切相關(guān)。由于腫瘤生長(zhǎng)迅速，血液供應(yīng)相對(duì)不足，產(chǎn)生了低糖、缺氧及酸中毒的微環(huán)境，這種微環(huán)境能夠誘導(dǎo)糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein, GRP78）的表達(dá)，而GRP78具有維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定、保護(hù)細(xì)胞的作用[1,2]。鈣離子拮抗劑A23187是一種Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以破壞細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子平衡，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞合成GRP78[3]。有研究[4]表明GRP78在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性有關(guān)。我們?cè)鴮?duì)大細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌中GRP78的表達(dá)與VP-16耐藥之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究[5,6]。但關(guān)于GRP78在肺腺癌中的表達(dá)情況及其表達(dá)是否與腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的耐藥具有相關(guān)性，目前國(guó)內(nèi)外研究較少。本研究旨在通過(guò)對(duì)在誘導(dǎo)劑A23187作用下肺腺癌細(xì)胞SPCA-1中GRP78表達(dá)水平的檢測(cè)及其表達(dá)與肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的相關(guān)性的分析，探討GRP78在肺腺癌對(duì)順鉑耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肺腺癌SPCA-1標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株，購(gòu)于中科院細(xì)胞研究所。

1.1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液、A23187、順鉑、Trizol（Sigma產(chǎn)品），RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL2000（Takara產(chǎn)品），羊抗人GRP78抗體、羊抗人β-actin抗體、HRP-兔抗羊IgG（Santa Cruz公司），ECL試劑盒（Amershan公司），MTT（Amresco公司），DMSO 、A23187、順鉑（Sigma公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SPCA-1細(xì)胞株復(fù)蘇后培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、飽和濕度37oC的孵箱中培養(yǎng)。將5×104個(gè)細(xì)胞接種于25 mL的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，再將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度A23187（1 μM、2 μM、4 μM、6 μM）；對(duì)照組加入PBS，培養(yǎng)24 h。

1.2.2 RNA提取以及RT-PCR 按試劑盒說(shuō)明分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，制備cDNA，進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。GRP78 mRNA上游引物序列為5' GATAATCAACCAACTGTTAC 3'，下游引物序列為5' GTATCCTCTTCACCAGTTGG 3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為577 bp；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5'TCGTCACCAACTGGGACGACATGG 3'，下游引物序列為5' GATCTTGATCTTCATTGTGCTGGG 3'， 預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為750 bp。PCR循環(huán)參數(shù)：94oC預(yù)變性4 min，94oC變性1 min，58oC退火30 s，72oC 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72oC再延伸10 min。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL、PCR引物各1 μL、5×PCR Buffer 10 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、dNTP混合物1 μL、Taq酶0.25 μL。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用美國(guó)UVP凝膠成像系統(tǒng)EC3 System進(jìn)行掃描分析，計(jì)算公式為：某樣品GRP78 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平=樣品GRP78的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.3 蛋白提取及Western雜交 將細(xì)胞置于1.5 mL Eppendorf管中，加入RIPA緩沖液300 μL，以12 000 rpm速度、4oC離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新管，再重復(fù)離心2次，-70oC保存；Kobayashi等[7]使用Bradford比色法測(cè)定蛋白含量，依次進(jìn)行SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)印。取下轉(zhuǎn)印好的PVDF膜，放入封閉液中4oC封閉過(guò)夜，加入稀釋的羊抗人GRP78抗體（一抗，1:400）及羊抗人β-actin（一抗，1:400）， 37oC孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min。再加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG（二抗，1:5 000），37oC孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，在室溫進(jìn)行ECL顯色。用美國(guó)UVP公司EC3 System凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描分析，計(jì)算公式為：某樣品GRP78蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=樣品GRP78的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.4 MTT比色法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組SPCA-1細(xì)胞，用RPIM-1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL培養(yǎng)基，置于5 %CO2、飽和濕度的37oC孵箱培養(yǎng)24 h。然后，加入不同濃度的順鉑（0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM），每個(gè)濃度設(shè)1個(gè)主孔2個(gè)副孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，再向各孔加入MTT 20 μL，4 h后加DMSO溶解甲臢，在酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm，檢測(cè)各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞生存率及IC50。細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%；IC50：使用Bliss法計(jì)算；耐藥指數(shù)（resistance index, RI）=IC50實(shí)驗(yàn)組/IC50對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MEAN±SD表示，采用 SPSS 12.0軟件處理，用單向方差分析比較多組間均數(shù)的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌SPCA-1細(xì)胞中GRP78核酸水平的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示：對(duì)照組GRP78核酸的相對(duì)表達(dá)量為0.165±0.007 3；實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)A23187濃度為1 μM-6 μM時(shí)，GRP78核酸的相對(duì)表達(dá)量分別為0.495±0.030、0.604±0.031、0.705±0.046 和0.890±0.046；與對(duì)照組相比，其表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的A23187濃度依賴性（圖1）。

2.2 肺腺癌SPCA-1細(xì)胞中GRP78蛋白水平的表達(dá) Western雜交結(jié)果顯示：對(duì)照組GRP78蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.304±0.003；實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)A23187濃度為1 μM-6 μM時(shí)，GRP78蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.545±0.004、0.763±0.012、0.864±0.023和0.892±0.034。與對(duì)照組相比，其表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05），并呈現(xiàn)一定的A23187濃度依賴性（圖2）。

2.3 細(xì)胞生存率與GRP78表達(dá)的相關(guān)性 不同濃度A23187誘導(dǎo)下細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值。對(duì)照組IC50為5.73±0.43；實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)A23187濃度為1 μM、2 μM、4 μM、6 μM時(shí)，其IC50值分別為：7.06±0.37、4.23±0.17、3.84±0.32和3.03±0.24?？梢?jiàn)在相同濃度順鉑作用下，當(dāng)A23187濃度為2 μM、4 μM、6 μM時(shí)，其所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生存率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），且其降低呈現(xiàn)一定的A23187濃度依賴性。結(jié)合前述GRP78在核酸和蛋白水平表達(dá)的特點(diǎn)，即A23187對(duì)GRP78的表達(dá)呈濃度依賴性誘導(dǎo)，提示肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性與GRP78表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖3）。

圖 1 不同濃度A23187誘導(dǎo)下SPCA-1細(xì)胞GRP78核酸水平的表達(dá)Fig 1 Expression of GRP78 mRNA in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrationsA: RT-PCR results of GRP78 mRNA in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrations (0 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM) for 24 h; B: Bar graph showing the relative level of GRP78 mRNA evaluated using the ratio of IODGRP78/IODβ-actin. Data represent mean values and bars indicate the SD of triplicate determinations.*P＜0.05 compared to the control.

圖 2 不同濃度A23187誘導(dǎo)下SPCA-1細(xì)胞GRP78蛋白水平的表達(dá)Fig 2 Expression of GRP78 protein in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrationsA: Western blot results of GRP78 protein in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrations (0 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM) for 24 h; B: Bar graph showing the relative level of GRP78 protein evaluated using the ratio of IODGRP78/IODβ-actin. Data represent mean values and bars indicate the SD of triplicate determinations.*P＜0.05 compared to the control.

圖 3 不同濃度A23187誘導(dǎo)下的SPCA-1細(xì)胞對(duì)順鉑的生存曲線Fig 3 Survival curves of SPCA-1 cells to cisplatin after being induced by A23187 at different concentrations

3 討論

GRP78具有促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白恢復(fù)正常構(gòu)象、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)Ca2+平衡并調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+依賴性蛋白修飾反應(yīng)、對(duì)抗氧化應(yīng)激，從而保護(hù)細(xì)胞的作用[8]。各種應(yīng)激條件如葡萄糖缺乏、蛋白錯(cuò)誤折疊、蛋白糖基化及一些誘導(dǎo)劑（如Ca2+-ATPase抑制劑thapsigargin）都可以激活GRP78轉(zhuǎn)錄基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生GRP78[3,9,10]。近年來(lái)的研究[11]發(fā)現(xiàn)應(yīng)激條件下細(xì)胞合成和高度表達(dá)GRP78的反應(yīng)，可能是細(xì)胞的一種重要防御機(jī)制。該機(jī)制對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，能夠延長(zhǎng)在各種不利因素刺激下的細(xì)胞生存期[12-14]。而且，GRP78在一些腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性有一定影響。

A23187是一種Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)載體，作用于細(xì)胞后，可使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度（[Ca2+]ER）下降，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]c）增加。因而，可以造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+失衡，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，激活GRP78基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生GRP78[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)A23187 可以誘導(dǎo)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460及人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446 GRP78的表達(dá)[5,6]。本研究表明：A23187也可以明顯誘導(dǎo)人肺腺癌SPCA-1細(xì)胞GRP78在蛋白及核酸水平的表達(dá)。

順鉑屬細(xì)胞周期非特異性藥物，其抗癌譜廣，自70年代開(kāi)始用于臨床以來(lái)，已成為治療肺癌、食管癌、惡性淋巴瘤、卵巢癌等多種惡性腫瘤的一線化療藥物。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，當(dāng)A23187濃度為2 μM、4 μM、6 μM時(shí)，SPCA-1細(xì)胞中GRP78的表達(dá)明顯升高，相應(yīng)的細(xì)胞在順鉑作用下的生存率卻明顯降低，表明A23187誘導(dǎo)下的GRP78高表達(dá)與SPCA-1細(xì)胞順鉑耐藥呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，即GRP78高表達(dá)能夠提高肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Mese等[15]通過(guò)對(duì)人表皮細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，GRP78表達(dá)增高能夠提高野生株A431細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，而對(duì)耐藥株A431/CDDP2細(xì)胞沒(méi)有影響。Belfi等[16]利用實(shí)驗(yàn)證明人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW480與VACO-8中GRP78的表達(dá)增高，可以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Satadal等[17]通過(guò)對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠V79細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，在兩種誘導(dǎo)劑6-氨基煙堿與2-脫氧葡萄糖的作用下，GRP78的表達(dá)水平均明顯增高，與此相對(duì)應(yīng)，V79細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性亦明顯增強(qiáng)。順鉑主要通過(guò)與DNA分子形成鏈內(nèi)或鏈間交叉聯(lián)接或阻止RNA分子再?gòu)?fù)制等途徑發(fā)揮抗腫瘤藥理作用，GRP78高表達(dá)能夠提高細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性的機(jī)制主要與DNA交聯(lián)修復(fù)有關(guān)。一方面，GRP78能夠減慢DNA交聯(lián)產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)脫失的速度；另一方面，GRP78還能夠削弱DNA加和物切補(bǔ)修復(fù)，從而導(dǎo)致DNA交聯(lián)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間延遲，增強(qiáng)藥物的敏感性[17]。

當(dāng)然，肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥是多因素多因子共同參與的復(fù)雜過(guò)程，除了細(xì)胞微環(huán)境中的GRP78的作用以外，其它機(jī)制如藥物流入減少或流出增加、與谷胱甘肽或金屬硫蛋白結(jié)合、機(jī)體對(duì)藥物的解毒作用增強(qiáng)、DNA修復(fù)以及DNA復(fù)制損傷等也與此相關(guān)。因此，肺癌順鉑耐藥機(jī)制值得進(jìn)一步研究。