地塞米松對順鉑誘導(dǎo)中國人肺腺癌原代細(xì)胞凋亡的影響

尹滿香 張成文 楊勇 林雪平 吳達(dá)龍

過去50年以來，肺癌逐漸成為主要的癌癥死亡原因。雖然對肺癌治療方法有了很大的改進(jìn)，但肺癌的遠(yuǎn)期生存率依然很低。該病預(yù)后差，約80%的患者在確診后一年內(nèi)死亡[1,2]。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，90%以上腫瘤患者的死亡受不同程度的耐藥影響。糖皮質(zhì)激素如地塞米松（dexamethasone, DEX）被引入腫瘤治療的原因包括：①對淋巴細(xì)胞有促凋亡的作用；②在治療因腫瘤引發(fā)的水腫、炎癥、疼痛及電解質(zhì)失衡等方面起著積極的作用；③能減緩因腫瘤藥物細(xì)胞毒性作用所引發(fā)的惡心和嘔吐[3-5]。Herr等[6]報道了DEX能降低因抗癌化療藥物順鉑（cisplatin, CIS）誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞株P(guān)693細(xì)胞內(nèi)凋亡基因量的表達(dá)，并提高抗凋亡蛋白基因量的表達(dá)，使得CIS聯(lián)合DEX的P693細(xì)胞生長速度比單獨由CIS處理的P693細(xì)胞快得多。隨后，其研究組對歐洲的肺癌原代細(xì)胞接受CIS聯(lián)合DEX處理后發(fā)現(xiàn)，DEX能降低CIS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果[7]。這一結(jié)果與早些時候觀察到的DEX對淋巴細(xì)胞有促進(jìn)凋亡作用相反[8]。而在我國肺腺癌化療時，常規(guī)化療方案中都含有一種鉑類藥物。因此，目前有必要評估DEX對肺腺癌細(xì)胞接受鉑類藥物如CIS的影響。本實驗收集了自2008年3月-2008年9月間入住武警浙江省總隊醫(yī)院、并經(jīng)病理學(xué)確診為肺腺癌的10例中國人患者的腫瘤切除標(biāo)本，并分離出其原代肺腺癌細(xì)胞，參照化療藥物CIS的臨床濃度，經(jīng)聯(lián)合不同濃度DEX處理的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察，以模擬肺腺癌細(xì)胞接受CIS化療聯(lián)合DEX治療的效果。因原代細(xì)胞不適合凋亡實驗的分析和長時間的培養(yǎng)，故本研究的肺腺癌原代細(xì)胞用細(xì)胞株A549細(xì)胞替代。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 本研究自2008年3月-2008年9月之間，收集10例經(jīng)臨床和病理學(xué)診斷為肺腺癌的手術(shù)切除組織標(biāo)本，其中男性6例，女性4例，年齡45歲-74歲，平均年齡61.7歲。病人從未接受過抗癌治療。肺腺癌標(biāo)本取材均經(jīng)患者同意并獲得武警浙江省總隊醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，根據(jù)WHO（2004）肺腫瘤組織學(xué)分類法和國際抗癌聯(lián)盟（UICC）1997年修訂的p-TNM分期標(biāo)準(zhǔn)包括肺腺癌IIa+IIb期10例（高分化4例、中分化6例）。10例肺腺癌病例按臨床常規(guī)和WHO病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤臨床分期，見表1。

1.2 人肺腺癌細(xì)胞株A549及培養(yǎng) 無菌條件下，把人肺腺癌細(xì)胞株A549置于含有10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，pH值7.2-7.4）中，在37oC、5%CO2和相對濕度90%的培養(yǎng)箱中常規(guī)條件下孵育，隔日換液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗。肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.3 藥物及儀器 實驗所用的DEX、CIS和四氮唑藍(lán)為美國Sigma產(chǎn)品，二甲基亞砜（DMSO）由蘇州正興化工研究所分裝提供，Annexin V FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)板購自無錫耐思生物科技有限公司，臺盼藍(lán)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。實驗所涉及的儀器包括：SW-LZ-2FO超凈工作臺、Forma3111型CO2培養(yǎng)箱、Olympus CK40倒置相差顯微鏡、BIO-せD-Model 550酶標(biāo)儀、德國Partec PAS型流式細(xì)胞儀等。

1.4 原代肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)及DEX對CIS抑制肺腺癌細(xì)胞株A549生長的影響 取新鮮的肺腺癌手術(shù)切除的組織標(biāo)本，撕碎后過100目銅網(wǎng)，濾過液300 g離心2 min，沉淀中加入20%滅活的小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，37oC懸浮2 min-3 min，按上法離心，重復(fù)3次。然后用20%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸沉淀中的單個肺癌原代細(xì)胞。細(xì)胞懸液用0.5%臺盼藍(lán)染色，顯微鏡下檢測活細(xì)胞數(shù)目為98%以上，再按上法離心后，用含20%滅活小牛血清的RPMI-1640配制細(xì)胞密度為5.0×105個/mL的肺腺癌原代細(xì)胞懸液。96孔板每孔加100 μL原代細(xì)胞懸液，在37oC、5%CO2和相對濕度90%中培養(yǎng)。

在直徑為3.0 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，配制肺腺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞濃度為1×104個/mL，于+/-DEX調(diào)至終濃度為1.0 μmol/L 培養(yǎng)24 h，再經(jīng)過+/-CIS 7 μmoL/L處理，并同空白對照組共4組培養(yǎng)2周和3周，培養(yǎng)條件為37oC、5%CO2和相對濕度90%。使用倒置顯微鏡拍照，并用0.5%臺盼藍(lán)染色，顯微鏡下記錄活細(xì)胞數(shù)目，以對照組為100%，然后根據(jù)實驗組活細(xì)胞數(shù)/對照組活細(xì)胞數(shù)×100%來計算不同實驗組的細(xì)胞存活率。

表 1 10例肺癌病人癌組織學(xué)特征Tab 1 Characteristics of lung tumour tissues from 10 patients

1.5 腫瘤細(xì)胞生長增殖試驗 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔分別接種細(xì)胞密度為5.0×105個/mL肺腺癌原代細(xì)胞，分別加入DEX調(diào)至濃度為0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10.0 μmol/L和空白對照，在5%CO2、37oC和相對濕度90%條件中培養(yǎng)24 h。然后再以+/-CIS調(diào)至終濃度分別為7.0 μmol/L、17.0 μmol/L和34.0 μmol/L處理。各濃度均重復(fù)8孔。實驗中以含20%滅活小牛血清RPMI-1640的等量肺腺癌原代細(xì)胞作為對照。再把上述培養(yǎng)板于5%CO2、37oC和相對濕度90%中培養(yǎng)48 h后，采用MTT比色法檢測A550 nm吸收值，并計算出不同濃度的CIS下對經(jīng)DEX處理過的肺原代細(xì)胞的生長率，計算公式為：生長率=試驗組A550 nm值/對照組A550 nm值×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)測定經(jīng)CIS+/-DEX處理的肺腺癌細(xì)胞株A549的凋亡率 把細(xì)胞株A549按2×105個/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按空白對照組、CIS組（17.0 μmol/L）、DEX組（1.0 μmol/L）和CIS（17.0 μmol/L）+DEX（1.0 μmol/L）組培養(yǎng)48 h，每組設(shè)3個復(fù)孔。經(jīng)細(xì)胞消化、收集，將細(xì)胞懸液以300 g離心3 min，棄上清液，用PBS離心清洗3次，然后細(xì)胞沉淀用100 μL結(jié)合緩沖液混懸，向細(xì)胞懸液加20 μL Annexin V-FITC混勻后避光1 h在冰上孵育，然后再加5 μL PI混勻后在冰上孵育5 min，再加500 μL結(jié)合緩沖液上Partec PAS型流式細(xì)胞儀檢測，記錄細(xì)胞凋亡值。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析實驗數(shù)據(jù)。肺癌細(xì)胞增殖試驗A550 nm值以Mean±SD表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 DEX對CIS抑制肺腺癌原代細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響 10例肺腺癌原代細(xì)胞經(jīng)CIS+/-DEX處理后，根據(jù)MTT測定的結(jié)果繪制細(xì)胞培養(yǎng)增殖曲線見圖1。結(jié)果顯示，在10例中國人源的肺腺癌原代細(xì)胞中，CIS能明顯抑制肺腺癌原代細(xì)胞增殖，但在聯(lián)合DEX處理下，CIS抑制肺腺癌原代細(xì)胞增殖的效應(yīng)受到了不同程度的抑制。

2.2 DEX降低CIS誘導(dǎo)的肺腺癌原代細(xì)胞死亡率和增加生存率 分離5號和10號病人被切除的肺腺癌的原代細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，對培養(yǎng)2 d、4 d和6 d的細(xì)胞用0.5%臺盼藍(lán)染色后在顯微鏡下觀測活/死細(xì)胞并計數(shù)，實驗重復(fù)3次，結(jié)果如表2顯示?？梢钥闯觯珼EX能減少CIS誘發(fā)肺腺癌原代細(xì)胞的死亡率，相對增加其生存率。

2.3 DEX干擾CIS抑制肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖的影響由于原代細(xì)胞不適合長時間的培養(yǎng)，本研究選用與肺腺癌相同的細(xì)胞株A549細(xì)胞替代原代細(xì)胞。圖2結(jié)果顯示，單獨接受CIS處理的A549細(xì)胞2周和3周后，出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡；而CIS聯(lián)合DEX處理的A549細(xì)胞，在2周和3周后細(xì)胞死亡率明顯減少，相對細(xì)胞生存量較多，實驗重復(fù)4次。表3結(jié)果顯示，單獨接受CIS培養(yǎng)的A549細(xì)胞生存率僅在35%-37%之間，而CIS聯(lián)合DEX處理下的A549的生存率卻高達(dá)54%-67%，這說明DEX能減弱CIS誘導(dǎo)A549細(xì)胞的死亡效應(yīng)。

2.4 DEX對CIS抑制肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞凋亡效應(yīng)的影響 在A549細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀記錄結(jié)果如圖3所示，QA1為早期凋亡細(xì)胞群，QA2為晚期凋亡細(xì)胞群，QA3為活細(xì)胞群，QA4是死亡細(xì)胞群?？瞻讓φ战M、DEX組、CIS組和DEX+CIS組的早期凋亡率分別為4.9%、4.38%、44.09%和19.69%；晚期凋亡率分別為0.98%、0.6%、4.93%和3.68%。QA4是死亡細(xì)胞群，用以排除已死亡的細(xì)胞對受化療藥物引發(fā)凋亡的細(xì)胞檢測結(jié)果的干擾，即排除假陽性。結(jié)果說明DEX能明顯降低CIS誘導(dǎo)A549細(xì)胞的早、晚期凋亡效應(yīng)。

表 2 DEX促進(jìn)細(xì)胞增殖或抑制細(xì)胞死亡（n=3）Tab 2 DEX promotes proliferation and inhibits CIS-induced death of fresh lung carcinoma samples (n=3)

圖 1 DEX對CIS抑制肺癌原代細(xì)胞增殖的影響（n=10）10例肺腺癌原代細(xì)胞經(jīng)+/-DEX（0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L）培養(yǎng)24 h后，再分別加入+/-CIS（7.0 μmol/L、17.0 μmol/L和34.0 μmol/L），再經(jīng)48 h培養(yǎng)后，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖率。Fig 1 DEX promotes CIS-inhibited proliferation of primary lung carcinoma cells(n=10)Tumor cells were isolated from 10 resected Chinese human lung adenocarcinoma specimens and were cultivated in a concentration of 5.0×105/mL in the absence(white bars) or presence of DEX (0.1 μmol/L, 1.0 μmol/L or 10.0 μmol/L) for 24 h.Thereafter, cisplatin was added in different concentrations (7.0 μmol/L, 17.0 μmol/L or 34.0 μmol/L) or not (CO), and the cell viability was measured by the MTT-assay after additional 48 h incubation.

表 3 DEX對CIS抑制A549細(xì)胞增殖率的影響Tab 3 The effect of DEX on CIS mediated suppression of proliferation of A549 (n=4, Mean ±SD)

3 討論

鉑類藥物如CIS是臨床上最為常用的抗癌化療藥物，CIS進(jìn)入癌細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)DNA分子形成鏈內(nèi)或鏈間交叉聯(lián)接，導(dǎo)致DNA分子復(fù)制障礙，以此抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[9-11]。糖皮質(zhì)激素如DEX被引入肺癌輔助治療，是由于它對淋巴細(xì)胞有著促凋亡和抗增殖的作用，還能減輕肺腺癌化療引起的毒、副反應(yīng)和肺腺癌自身引起的其它不良癥狀。中國人肺腺癌接受化療時，一般采用DEX協(xié)同鉑類抗癌藥物如CIS治療[12]。國內(nèi)有研究[13]小組利用小鼠動物模型就缺氧誘導(dǎo)因子-1α對肺細(xì)胞生長、分化及對血管內(nèi)皮生成因子等的表達(dá)進(jìn)行了系列研究，并通過DEX降低胞外信號調(diào)控激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，其抑瘤機制是DEX通過誘導(dǎo)MKP-1增加從而降低了VGEF的表達(dá)，減弱了有助腫瘤滋養(yǎng)的血管生長，因此產(chǎn)生抑制癌組織生長的可能。國內(nèi)有綜述[14]報道糖皮質(zhì)激素有助于肺癌的化療效應(yīng)，其理由是糖皮質(zhì)激素增加了細(xì)胞內(nèi)P21和P27的表達(dá)，以此提高了P53對細(xì)胞周期的調(diào)控，引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

圖 2 DEX對CIS誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)（×200）A：A549細(xì)胞的空白對照組；B：1.0 μmol/L DEX；C：7.0 μmol/L CIS；D：1.0 μmol/L DEX+7.0 μmol/L CIS條件下培養(yǎng)2周的A549細(xì)胞；E： A549細(xì)胞空白對照組；F：1.0 μmol/L DEX；G：7.0 μmol/L CIS；H：1.0 μmol/L DEX+7.0 μmol/L CIS條件下培養(yǎng)3周的A549細(xì)胞。Fig 2 The inhibitory effect of DEX on CIS-induced A549 cell proliferation (×200)Cell line A549 were treated as described as (A: CO; B: 1.0 μmol/L DEX; C: 7.0 μmol/L CIS; D: 1.0 μmol/L DEX plus 7.0 μmol/L CIS) for 2 weeks; and (E: CO; F: 1.0 μmol/L DEX; G: 7.0 μmol/L CIS; H: 1.0 μmol/L DEX plus 7.0 μmol/L CIS) for 3 weeks.

圖 3 流式細(xì)胞儀測定CIS聯(lián)合DEX處理肺腺癌細(xì)胞A549體外培養(yǎng)48 h的凋亡率QA1：早期凋亡細(xì)胞；QA2：晚期凋亡細(xì)胞群；QA3: 活細(xì)胞群；QA4：死亡細(xì)胞群；CO：細(xì)胞對照；DEX：1.0 μmol/L DEX；CIS：17.0 μmol/L CIS和DEX/CIS：1.0 μmol/L DEX+17圖.0 μm4o流l/L 式CIS細(xì) 條胞件下儀培測養(yǎng)定48 hC的IAS54聯(lián)9細(xì)合胞D凋E亡X分析處。理肺腺癌細(xì)胞A549體外培養(yǎng)凋亡率Fig 3 The apoptosis rate of A549 cells in vitro treated with CIS+/-DEX for 48 h by flow cytometryQA1: early apoptoticQ cAell 1ra：te; 早QA期2: la凋te a亡po細(xì)pto胞tic c；ell rQatAe;： Q2A晚3: v期iab凋le c亡ell r細(xì)ate;胞 QA群4: deaQthA ce3ll :r at活e.細(xì)胞群；QA4：死亡細(xì)胞群。CO：細(xì)胞對照；Cell line A549 were treated for 48 h as indicated, CO: no treated control, DEX: 1.0 μmol/L DEX, CIS: 17.0 μmol/L CIS and DEX/CIS: 1.0 μmol/L DEX plus 17.0 μmol/L CIS, and celDl aEpoXpt：otic1 r aμtem waosl m/Lea sDurEedX b；y floCwI cSy：tom1e7tr yμ.mol/LCIS 和 DEX/CIS：1 μmol/L DEX+17 μmol/L CIS 條件下培養(yǎng)的

但有研究[6]表明肺腺癌細(xì)胞株P(guān)693細(xì)胞在CIS聯(lián)合DEX處理后，DEX不僅能降低細(xì)胞的凋亡蛋白CD95L、caspase-9等的基因表達(dá)，而且還增加了抗凋亡蛋白BCL2和XIAP基因的表達(dá)，因此，DEX抑制了化療藥物CIS誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡。令人感興趣的是，糖皮質(zhì)激素如何通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對腫瘤化療產(chǎn)生抑制作用。有研究[15]證實這與腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的特異性相關(guān)，其一種解釋是在不同類型細(xì)胞內(nèi)受體存在共同激活或抑制作用的差異性。Wu等[16]在比較乳腺癌細(xì)胞株的基因表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，DEX通過增加MKP-1蛋白的表達(dá)，降低CIS誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)JNK蛋白活性表達(dá)而消弱細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，其機制涉及不同基因序列調(diào)控位點、細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、細(xì)胞周期和DNA的修復(fù)等方面，最終能使凋亡蛋白的最終信號cleaved caspase-3片段表達(dá)明顯下降。另外，對于肺腺癌治療，糖皮質(zhì)激素能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或增殖，肺癌患者存在病因、種族和組織等的差異性，可能與細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[8]。

本研究中，10例經(jīng)病理學(xué)確診為肺腺癌患者的原代細(xì)胞，接受不同濃度的CIS聯(lián)合DEX處理，通過MTT方法檢測肺腺癌原代細(xì)胞的增殖狀況，圖1結(jié)果顯示DEX可降低細(xì)胞增殖受CIS抑制的效應(yīng)。在肺癌組織的5號和10號標(biāo)本中分離出的肺腺癌原代細(xì)胞，單獨接受CIS處理的實驗組出現(xiàn)大量的細(xì)胞死亡；與CIS聯(lián)合DEX處理的實驗組相比，其結(jié)果如表2所示，DEX能減少CIS引發(fā)的死亡量。由于肺腺癌原代細(xì)胞不適合長時間的培養(yǎng)和細(xì)胞凋亡率的檢測，本實驗選用了人類肺腺癌的A549細(xì)胞株代替原代細(xì)胞進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖2和表3所示，單獨接受CIS處理的A549細(xì)胞2周后，細(xì)胞死亡率達(dá)65%左右，3周后細(xì)胞死亡率則降低；相比CIS聯(lián)合DEX處理的A549細(xì)胞，在2周和3周后細(xì)胞死亡率明顯降低。同樣，用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如圖3顯示DEX能明顯降低CIS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。

近期有研究[17]表明糖皮質(zhì)激素能誘發(fā)增加肺腺癌細(xì)胞株A549的人類多耐藥基因MRP3的高表達(dá)，使得肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥。因此，結(jié)合本實驗的研究結(jié)果，提示有必要在中國人種的肺腺癌治療中再進(jìn)行大量的類似本實驗研究，確定糖皮質(zhì)激素對中國人群的肺腺癌化療影響是否存在著廣泛地降低CIS抗癌效應(yīng)，或者采用非類固醇類的藥物協(xié)同抗癌藥物進(jìn)行化療，以比較聯(lián)合糖皮質(zhì)激素的化療效應(yīng)。