晚期肺癌患者免疫功能的系統(tǒng)評(píng)價(jià)及臨床意義

烏蘭圖雅 王士勇 杜微麗 張暉 張遠(yuǎn) 曾雪 劉颯 劉艷萍 張璐 張哲 何英 王佳玲 武秀艷

免疫系統(tǒng)常常被賦予兩種截然不同的功能，對(duì)外來感染性病原體等表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答和排斥反應(yīng)，而對(duì)自身抗原表現(xiàn)出完全的無反應(yīng)或忽視。那么，對(duì)源于自身的腫瘤細(xì)胞，免疫系統(tǒng)應(yīng)該表現(xiàn)出怎樣的反應(yīng)？何以在看似正常的個(gè)體中產(chǎn)生腫瘤？70年代提出的免疫監(jiān)視學(xué)說不能很好地解釋這種對(duì)立的現(xiàn)象。新近的免疫編輯學(xué)說認(rèn)為，腫瘤免疫可分為3個(gè)階段：免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸。在腫瘤發(fā)展的早期，只能對(duì)那些免疫原性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出清除作用，同時(shí)“篩選出”免疫原弱的腫瘤細(xì)胞，使其成為腫瘤的優(yōu)勢細(xì)胞，進(jìn)一步增殖，達(dá)到免疫平衡、免疫逃逸。在后期的階段，腫瘤細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，直接抑制機(jī)體的免疫功能；或者，誘導(dǎo)產(chǎn)生如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等抑制性細(xì)胞[1,2]。因此，如何全面、真實(shí)地反映免疫功能依然是難題[3]。本研究選擇晚期肺癌患者，除了研究T、NK、B細(xì)胞外，也測定了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并結(jié)合體外的殺瘤活性、機(jī)制以及PPD等體內(nèi)檢測，以期能系統(tǒng)地評(píng)價(jià)患者的免疫功能，為適時(shí)的臨床干預(yù)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2009年1月-2009年6月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院住院的晚期肺癌患者40例，其中男性20例，女性20例，所有病人均經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診，其中鱗癌5例，腺癌30例，腺鱗癌3例，小細(xì)胞肺癌2例。根據(jù)AJCC第6版肺癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，III、IV期判定為晚期，年齡46歲-67歲，平均年齡（57.5±9.3）歲。所有病例均無糖尿病、嚴(yán)重感染及其它與自身免疫相關(guān)疾病，且3個(gè)月以內(nèi)未接受過化、放療及免疫治療。健康人對(duì)照組為中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院體檢中心的健康志愿者20例，男性10例，女性10例，年齡43歲-61歲，平均年齡（53.4±5.5）歲。

1.2 主要儀器和試劑 流式細(xì)胞儀為美國BD公司生產(chǎn)，型號(hào)FC-500-MPL。抗CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE/CD45-PerCP單克隆抗體和抗CD19-APC/CD3-FITC/CD16-PE CD56-PE/CD45-PerCP單克隆抗體四色試劑盒、抗CD4-FITC/CD25-PE/FOXP3-APC單克隆抗體試劑盒、IFN-γ/IL-4檢測用試劑盒、FITC標(biāo)記的穿孔素、PE標(biāo)記的顆粒酶熒光抗體、佛波酯、離子霉素、莫能霉素、破膜劑、溶血素均購自美國BD公司。CO2培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀為Anthos公司生產(chǎn)，型號(hào)Anthos 2010 SW-Version 1.8。

1.3 方法

1.3.1 免疫細(xì)胞計(jì)數(shù) 取病人及健康人外周肝素抗凝血2 mL，采用SysmexK-21全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)測定。

1.3.2 體液免疫測定 取病人及健康人外周肝素抗凝血2 mL，靜置，4 000 rpm離心10 min分離血清，用散射濁光計(jì)免疫法測定血清免疫球蛋白和補(bǔ)體水平。

1.3.3 外周血T、B、NK細(xì)胞比例測定 用流式細(xì)胞術(shù)測定，具體方法如下，各取外周肝素抗凝全血50 μL加入兩個(gè)流式管中，分別加入抗CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE/CD45-PerCP、抗CD19-APC/CD3-FITC/CD16-PE CD56-PE/CD45-PerCP熒光抗體各20 μL，混勻，避光靜置20 min后各管加入溶血素450 μL，混勻，避光靜置15 min，用流式細(xì)胞儀分析T、B、NK細(xì)胞在全血細(xì)胞中所占的比例。

1.3.4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞測定 用流式細(xì)胞術(shù)測定，具體方法如下，取病人及健康人外周肝素抗凝血各2 mL，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，取100 μL加入抗CD4-FITC/CD25-PE熒光抗體20 μL，4oC避光靜置30 min，加Flow cytometry staining buffer（流式細(xì)胞染色液）2 mL洗滌，離心5 min，棄上清，加固定/透膜劑1 mL，4oC避光靜置30 min，加破膜劑2 mL，離心5 min，棄上清；加抗FOXP3-APC熒光抗體20 μL，4oC避光靜置30 min，加破膜劑2 mL洗滌，離心5 min，棄上清，加流式細(xì)胞染色液2 mL洗滌兩次，加0.5 mL細(xì)胞染色液重懸細(xì)胞混勻，用流式細(xì)胞儀分析調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子及穿孔素及顆粒酶測定 用流式細(xì)胞術(shù)測定，具體方法如下，取病人及健康人外周肝素抗凝血各500 μL，加入RPMI-1640培養(yǎng)液500 μL、莫能霉素5 μL（1 mg/mL）、佛波酯20 μL（1 μg/mL）、離子霉素20 μL（20 μg/mL），37oC溫度下5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，PBS洗滌兩遍，離心5 min，小心吸棄上清，混勻；取樣500 μL，加CD3-PerCP、CD8-APC各20 μL，室溫避光孵育15 min，加溶血素2 mL，室溫避光孵育10 min，離心5 min，棄上清，加FACSLysis（通透劑）0.5 mL，室溫避光孵育10 min，加含0.5%BSA的PBS液2 mL，離心5 min，棄上清；加IFN-γ/IL-4試劑盒抗體20 μL或FITC-抗穿孔素抗體、PE-抗顆粒酶抗體試劑各20 μL，室溫避光孵育30 min，加PBS（含0.5%BSA）2 mL洗滌一次，后離心5 min，棄上清，加PBS 0.5 mL重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子及穿孔素及顆粒酶表達(dá)水平。

1.3.6 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 用MTT法測定，具體方法如下：靶細(xì)胞（肺癌細(xì)胞株A549及胃癌細(xì)胞株GM823均購于上海中科院細(xì)胞庫）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，用胰酶消化傳代，選對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104/mL，加入96孔板中，每孔100 μL，37oC、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h貼壁生長。將病人及健康人外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞（方法同1.3.4），按效:靶比20:1加入，共同培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。后離心5 min，小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液震蕩混勻，酶標(biāo)儀測定每孔570 nm光密度值（optical density, OD），計(jì)算抑制率。抑制率（%）=1-（殺傷組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值）/腫瘤細(xì)胞對(duì)照組OD值×100%。

1.3.7 體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn) 用結(jié)核菌素試驗(yàn)方法測定，即將PPD（人型結(jié)核菌素純蛋白衍生物）0.1 mL注射到人體前臂曲側(cè)中上部1/3處皮內(nèi)，觀察72 h反應(yīng)，以硬結(jié)大小作為判斷反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)：無硬結(jié)或硬結(jié)直徑≤4 mm為陰性；5 mm-9 mm為弱陽性；10 mm-19 mm為陽性；≥20 mm或雖＜20 mm但局部出現(xiàn)水泡和淋巴管炎等均為強(qiáng)陽性。

1.3.8 細(xì)胞增殖測定 取病人及健康人外周靜脈肝素抗凝血5 mL，通過淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，加入抗CD3抗體50 μL，共培養(yǎng)4 d，每24 h用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色記數(shù)活細(xì)胞，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，檢測結(jié)果以Mean±SD表示，除體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)外，其它數(shù)據(jù)均采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較 20例晚期肺癌患者外周血白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯低于健康對(duì)照組，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t分別為6.49、6.05、4.80，P分別為0.006、0.028、0.046），而晚期肺癌患者外周血中性粒細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與健康對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.67,P=0.217），結(jié)果見圖1。

2.2 體液免疫各項(xiàng)指標(biāo)的比較 20例晚期肺癌患者外周血中，IgG、IgA水平較健康對(duì)照組有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P分別為0.058、0.086）；IgM水平明顯低于健康對(duì)照組（P=0.003）；補(bǔ)體C3及C4水平均明顯高于健康對(duì)照組（P分別為0.012、0.004），結(jié)果見圖2。

2.3 外周血中T、B、NK和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的比較 20例晚期肺癌患者外周血中B細(xì)胞（CD19+）及NK細(xì)胞（CD3-CD16+CD56+）百分比顯著低于健康對(duì)照組（t分別為6.50、4.73，P分別為0.017、0.038）；晚期肺癌患者CD3+T細(xì)胞百分比顯著低于健康對(duì)照組（t=8.75,P=0.006）；患者CD4+T細(xì)胞百分比及CD4/CD8比例較健康對(duì)照組明顯減少（t分別為5.47、4.26，P分別為0.027、0.049），而晚期肺癌患者CD8+T細(xì)胞百分比較健康對(duì)照組增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.02, P=0.886）。此外，15例晚期肺癌患者CD4+CD25+T細(xì)胞百分比及CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞百分比明顯高于健康對(duì)照組（t值分別為5.17、5.93，P分別為0.034、0.024），結(jié)果見圖3A、B、C。

圖1 正常人及晚期肺癌患者外周血免疫細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的比較（×109）Fig 1 Comparisons of the absolute nucleated cell counts between advanced stage of lung cancer patients and healthy individuals (×109)

圖2 正常人及晚期肺癌患者體液免疫水平比較（g/L）Fig 2 Comparisons of the humoral immunity between advanced stage of lung cancer patients and healthy individuals (g/L)

圖3 晚期肺癌患者和健康人外周血T、B、NK和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的比較A：T、B、NK細(xì)胞；B：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；C：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。Fig 3 Comparisons of the cell immunity between advanced stage of lung cancer patients and healthy individualsA: T, B and NK cells; B: Regulatory T cells; C: The results of regulatory T cells detected by the flow cytometry.

圖4 健康人及晚期肺癌患者細(xì)胞因子水平測定結(jié)果A：柱狀圖；B：流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。Fig 4 Comparisons of the cytokine between advanced stage of lung cancer patients and healthy individualsA: Collumn; B: The results detected by flow cytometry.

圖5 正常人及晚期肺癌患者細(xì)胞內(nèi)穿孔素及顆粒酶比率的測定結(jié)果A：柱狀圖；B：流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。Fig 5 Comparisons of perforin and granzyme levels in serum between advanced stage of lung cancer patients and healthy individualsA: Collumn; B: The results detected by flow cytometry.

2.4 細(xì)胞內(nèi)IFN-γ和IL-4陽性率的比較 10例晚期肺癌患者CD8+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ陽性率顯著低于健康對(duì)照組，而患者IL-4陽性率明顯高于健康對(duì)照組（t分別為5.03、7.34，P分別為0.038、0.014），結(jié)果見圖4A、圖4B。

2.5 細(xì)胞內(nèi)穿孔素及顆粒酶陽性率的比較 10例晚期肺癌患者外周血CD8+T細(xì)胞內(nèi)穿孔素及顆粒酶陽性率均顯著低于健康對(duì)照組（t分別為5.27、9.14，P分別為0.041、0.011），結(jié)果見圖5A、圖5B。

2.6 免疫細(xì)胞體外細(xì)胞毒性比較 10例晚期肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)A549及GM823細(xì)胞增殖的平均抑制率分別為（13.92±1.48）%、（12.43±1.17）%，顯著低于健康對(duì)照組（27.49±5.42）%、（25.69±2.97）%（P＜0.05）。2.7 免疫細(xì)胞體內(nèi)細(xì)胞毒性比較 20例晚期肺癌患者PPD實(shí)驗(yàn)中，有16例為陰性，2例弱陽性，2例陽性；而健康對(duì)照組中有2例為陰性，7例弱陽性，兩者比較P＜0.01。

圖6 晚期肺癌患者及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖曲線Fig 6 The growth curve of the mononuclear cells in peripheral blood between advanced stage of lung cancer patients and healthy individuals

2.8 免疫細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的比較 10例晚期肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)4天，從第1天始，細(xì)胞增殖能力均顯著低于健康對(duì)照組（P分別為0.041、0.028、0.045、0.046），結(jié)果見圖6。

3 討論

一般認(rèn)為，NK細(xì)胞和T細(xì)胞亞群在腫瘤免疫監(jiān)視中起著重要的作用，其中CD3+/CD4+細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞亞群，CD4/CD8比值被視為監(jiān)視細(xì)胞免疫功能、反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[4]。本研究晚期肺癌患者外周血中免疫細(xì)胞絕對(duì)數(shù)顯著低于健康對(duì)照組，外周血CD3+、CD3+/CD4+、CD3-/CD16+56+T細(xì)胞百分比及CD4/CD8比值較健康對(duì)照組明顯降低，提示晚期肺癌患者的免疫細(xì)胞明顯減少。為了明確免疫細(xì)胞功能，本實(shí)驗(yàn)對(duì)晚期肺癌患者及健康對(duì)照組進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)及增殖試驗(yàn)，結(jié)果顯示，患者免疫細(xì)胞對(duì)瘤細(xì)胞株的抑制率及細(xì)胞增殖能力均低于健康對(duì)照組。而且晚期肺癌患者PPD試驗(yàn)陽性率明顯低于健康組，進(jìn)一步說明肺癌晚期病人免疫細(xì)胞功能低下。同時(shí)，患者外周血中主要效應(yīng)細(xì)胞CD8+T產(chǎn)生的穿孔素、顆粒酶陽性細(xì)胞百分比明顯低于健康組，進(jìn)一步在分子水平說明了腫瘤晚期機(jī)體免疫功能低下的原因。

隨著腫瘤免疫研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中并非被動(dòng)過程，而是通過釋放一些因子，誘發(fā)骨髓產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞[5]。CD4+CD25+T細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的在生理和病理狀態(tài)下均具有重要免疫調(diào)節(jié)作用的抑制性T細(xì)胞亞群，許多研究顯示，在多種腫瘤患者的血液中明顯升高，且與腫瘤的病理類型、臨床分期和預(yù)后有關(guān)[6-8]，是目前認(rèn)為反映腫瘤疾病程度和療效的良好指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，晚期肺癌患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞及CD4+/CD25+/FOXP3+Treg占CD4+T細(xì)胞比例均明顯高于健康對(duì)照組，提示晚期肺癌患者免疫功能失調(diào)與其比例增加有關(guān)。

腫瘤免疫抑制可通過抑制抗原提呈細(xì)胞的功能，繼而抑制T細(xì)胞的功能發(fā)揮，改變Th細(xì)胞因子的分泌譜，使Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-γ、IL-12和IL-2等）分泌水平下降，Th2型細(xì)胞因子（IL-10和IL-4等）分泌水平上升，即由Th1向Th2的漂移，從而誘導(dǎo)Treg（CD4+/CD25+/FOXP3+）細(xì)胞的產(chǎn)生，并增強(qiáng)其抑制功能，發(fā)生免疫逃逸[9]。本研究檢測結(jié)果顯示，IFN-γ在晚期肺癌組的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組，而IL-4相反，提示肺癌患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化明顯減少，而Th2細(xì)胞明顯增多，產(chǎn)生了由Th1向Th2的漂移。有研究認(rèn)為，肺癌組織本身通過局部分泌或全身作用于外周血單個(gè)核細(xì)胞、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞，使其向Th2轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，這可能是腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)性逃避和對(duì)抗機(jī)體免疫的機(jī)制之一[10]。

隨著單克隆抗體在臨床上的廣泛應(yīng)用[11-13]，體液免疫的抗腫瘤作用需再認(rèn)識(shí)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)展的早期階段B細(xì)胞可以通過使CD4+T細(xì)胞失活，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）免疫功能降低，從而促進(jìn)腫瘤的生長[14]。有研究表明，紫外線可以通過激活淋巴結(jié)內(nèi)B細(xì)胞來抑制樹突狀細(xì)胞的功能，從而介導(dǎo)腫瘤免疫耐受[15]。但是，近幾年的研究對(duì)腫瘤晚期患者B細(xì)胞是否也有免疫抑制作用結(jié)果不一致[16,17]，有待于進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)患者組CD19+B細(xì)胞數(shù)明顯低于健康對(duì)照組，原因尚不清楚。我們以往研究[18]及本研究中均發(fā)現(xiàn)腫瘤患者IgG、IgA升高，是一種抗腫瘤反應(yīng)？亦或是封閉性抗體？還是其它原因尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。但結(jié)合本研究中患者組補(bǔ)體C3、C4明顯高于健康對(duì)照組，或許提示即使在晚期肺癌病人中，IgG等升高可能是通過ADCC作用發(fā)揮抗腫瘤作用。

總之，晚期肺癌患者無論從數(shù)量、功能上，還是體外殺瘤活性、增殖能力、體內(nèi)PPD反應(yīng)以及免疫抑制細(xì)胞、分子水平上均反映免疫功能低下。但是，本研究未能動(dòng)態(tài)檢測免疫功能演進(jìn)狀態(tài)，為以后研究的方向。