hASH1在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達及其臨床意義

李菲 鐘志永 李銳 黃鶴宇 王麗君 鄭東晗 張道榮

hASH1（human achaete-scute homolog 1）基因是一個bHLH（basic helix-loop-helix）轉錄因子，首先從甲狀腺髓樣癌的cDNA文庫中克隆出來，位于12q22-q23[1,2]。在脊椎動物的發(fā)育過程中，ASH1基因通常只暫時性地表達于胚胎肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的早期分化階段，在終末分化標記物出現(xiàn)后其表達趨于沉默[3]。已有研究表明在具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的前列腺癌[4]、甲狀腺髓樣癌[5]、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌[6]中有hASH1基因的表達。目前臨床常用的非激素類神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標志物有嗜鉻粒蛋白A（Chromogranin A, CgA）、突觸素（Synaptophysin, Syn）和CD56等。本實驗通過免疫組織化學方法、Western blot和RT-PCR方法檢測肺腫瘤和正常肺組織中hASH1基因的表達情況，探討其作為更為特異和敏感的臨床病理診斷肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 收集166例肺癌組織蠟塊（鱗癌30例，腺癌30例，大細胞癌20例，典型類癌16例，非典型類癌20例，大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌10例，小細胞癌40例），其中35例取自遼寧省腫瘤醫(yī)院，其余取自中國醫(yī)科大學附屬一院，49例肺炎性假瘤及10例癌旁正常肺組織蠟塊取自中國醫(yī)科大學附屬一院。其中23例肺癌蠟塊有新鮮組織標本，9例鱗癌、9例腺癌和5例小細胞癌新鮮組織均取自中國醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院2008年5月-2009年5月手術切除標本，術中切除后立即置于-70oC冰箱保存，用于提取組織蛋白和RNA。

1.2 主要試劑和來源 濃縮型兔抗人ASH1多克隆抗體（ab38557）購自Abcam公司，即用型鼠抗人Chromogranin A單克隆抗體（MAB-0202）、鼠抗人Synaptophysin單克隆抗體（MAB-0078）、鼠抗人CD56單克隆抗體（RAB-0256）及即用型SP超敏免疫組織化學試劑盒（KIT-9710）和DAB酶底物顯色試劑盒（DAB-0031）均購自福州邁新生物技術公司。ECL超敏發(fā)光液P1010和RIPA裂解液C1053購自普利萊基因技術公司。濃縮型辣根酶標記山羊抗兔（ZB-2301）、山羊抗鼠（ZB-2305）抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。RNA抽提試劑盒Trizol購自Invitrogen公司，RT-PCR反應試劑盒購自北京全式金生物技術公司，引物序列合成由南京金思特有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學檢測 蠟塊標本制成4 μm切片，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法（SP法）檢測，具體步驟參見試劑盒說明書進行，所有標本均檢測hASH1（1:100）蛋白，所有肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌標本均檢測CgA、Syn和CD56的表達情況。每次染色均設立陽性對照，以PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.2 Western blot檢測 從組織內(nèi)提取細胞全蛋白, 取50 mg左右的組織塊，加入500 μL裂解液中，冰浴下勻漿后，低溫高速離心（4oC、12 000 g/min、20 min），收集上清。用考馬斯亮蘭法，以牛血清蛋白作為標準進行蛋白定量，計算各樣品蛋白濃度。取總蛋白量80 μg上樣，進行SDS-PAGE電泳分離。電泳條件：穩(wěn)定電壓80 V、30 min，待濃縮膠將蛋白質濃縮成一條直線后調(diào)至120 V、2 h，待溴芬蘭進入凝膠底部后取出凝膠，根據(jù)預染Maker（Fermentas公司）標記切取所需相應分子量蛋白條帶，將蛋白轉印到PVDF 膜上（40 V恒壓，4oC濕轉100 min）， 5%脫脂奶粉封閉2 h，加兔抗人ASH1抗體（1:500），4oC孵育過夜，TTBS（20 mmol/L Tris-HCL,500 mmol/L NaCl, 0.05% Tween-20）漂洗3次后，加山羊抗兔（1:5 000）二抗溫育120 min，TTBS漂洗3次后行ECL顯色，X線膠片曝光成像，以β-actin為內(nèi)參照，最后經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像。

1.3.3 RT-PCR檢測 利用Trizol提取組織中總的RNA，具體操作步驟參見說明書進行，總RNA純度和濃度使用紫外分光光度計（NanoPhotometer, Germany）測定，經(jīng)測定所用樣品的A260/A280比值都在1.8-2.0之間。反轉錄過程按說明書操作。hASH1引物：上游序列5’-TCCCCCAACTACTCCAACGAC-3’，下游序列是5’-CCCTCCCAACGCCACTG-3’，產(chǎn)物大小為233 bp；內(nèi)參β-actin引物：上游5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGA AAC-3’，下游5’-TAAAACGCAGCTCGATAACAGTCCG-3’，產(chǎn)物大小為250 bp。循環(huán)條件為：94oC預變性5 min，94oC變性30 s，55oC退火30 s，72oC延伸30 s，30個循環(huán)后于72oC延伸5 min，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后保存圖像。

1.4 結果判定

1.4.1 免疫組織化學結果判定 hASH1在細胞核呈現(xiàn)棕黃色細小顆粒者為陽性染色，CgA、Syn在細胞漿呈現(xiàn)棕黃色細小顆粒者為陽性染色，CD56在細胞膜和細胞漿呈現(xiàn)棕黃色細小顆粒者為陽性染色。每張切片在400倍鏡下觀察10個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞。陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11%-50%為2分，50%-75%為3分，≥75%為4分；再按染色強度評分：無色為0，淡色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后按照乘積分數(shù)分為4個等級：“-”（0-2），“+”（3-5），“++”（6-8），“+++”（9-12）。染色結果判定：分數(shù)≥3定為陽性，＜3為陰性。

1.4.2 Western blot結果判定 hASH1的條帶在25 kDa處，用圖像分析軟件測定各樣品灰度值，并取其與β-actin的比值作為相對表達量進行比較分析。

1.4.3 RT-PCR結果判定 hASH1在233 bp處出現(xiàn)高亮條帶，用圖像分析軟件測定各樣品光密度值，并取其與β-actin的比值作為相對表達量進行比較分析。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，對hASH1在各種肺組織中表達的差異采用χ2檢驗（n＞40）或Fisher確切概率法（n＜40）分析，采用Spearman等級相關分析hASH1與CgA、Syn、CD56表達的相關性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學結果

2.1.1 hASH1在正常肺組織、肺炎性假瘤和非小細胞肺癌中的表達情況 在10例正常肺組織、49例肺炎型假瘤、30例鱗癌、30例腺癌和20例大細胞癌中均無hASH1的表達。

2.1.2 hASH1在類癌中的表達情況 在16例典型類癌中有2例陽性表達，陽性率為12.5%，在20例非典型類癌中有15例陽性表達，陽性率為75%（圖1），hASH1在典型類癌和非典型類癌中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 hASH1、CgA、Syn和CD56分別在TC、AC、LCNEC和SCLC中的表達情況（SP, ×400）TC：典型類癌；AC：不典型類癌；LCNEC：大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌；SCLC：小細胞肺癌；hASH1：human achaete-scute homolog 1；CgA：嗜鉻粒蛋白A；Syn：突觸素。Fig 1 Expression of hASH1, CgA, Syn and CD56 in TC, AC, LCNEC and SCLC respectively (SP, ×400)TC: typical carcinoid; AC: atypical carcinoid; LCNEC: large cell neuroendocrine carcinoma; SCLC: small cell lung cancer; hASH1: human achaete-scute homolog 1;CgA: Chromogranin A; Syn: Synaptophysin.

圖2 Western blot檢測hASH1蛋白在肺癌組織中的表達A：肺鱗癌、腺癌和小細胞癌組織中hASH1和β-actin的蛋白表達情況，以β-actin為內(nèi)參；B：hASH1的蛋白表達量與β-actin相比后的相對表達量。可見在肺鱗癌、腺癌中均無hASH1蛋白的表達，在5例小細胞癌中hASH1蛋白的表達均較高；SC：鱗癌；AC：腺癌。Fig 2 Expression of hASH1 protein in different lung cancer tissues by Western blotA: Western blot results of hASH1 protein expression in squamous cell carcinoma, adenocarcinomas and small cell lung carcimoma, β-actin served as an internal control; B: The histogram of relative expression rate of hASH1 protein compared to β-actin. There is no expression of hASH1 protein in squamous cell carcinoma and adenocarcinomas, but in five small cell lung carcimoma the expression level is high; SC: squamous cell carcinoma; AC: adenocarcinomas.

圖3 RT-PCR檢測hASH1 mRNA在肺癌組織中的表達A：肺鱗癌、腺癌和小細胞癌組織中hASH1和β-actin的mRNA經(jīng)RT-PCR后的電泳結果，以β-actin為內(nèi)參；B：hASH1 mRNA表達量與β-actin相比后的相對表達量。可見在肺鱗癌、腺癌中均無hASH1 mRNA的表達，在5例小細胞癌中hASH1 mRNA均高表達。Fig 3 Expression of hASH1 mRNA in different lung cancer tissues by RT-PCRA: RT-PCR results of hASH1 mRNA expression in squamous cell carcinoma,adenocarcinomas and small cell lung carcimoma, β-actin served as an internal control; B: The histogram of relative expression rate of hASH1 mRNA compared to β-actin.There is no expression of hASH1 mRNA in squamous cell carcinoma and adenocarcinomas, but in five small cell lung carcimoma the expression level is high.

表1 在肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中hASH1與CgA、Syn、CD56表達的關系Tab 1 Correlation of expression between hASH1and CgA, Syn, CD56 in pulmonary neuroendocrine carcinoma

2.1.3 hASH1在大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細胞癌中的表達情況 在10例大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中有6例陽性表達，陽性率為60%，在40例小細胞癌中31例陽性表達，陽性率為77.5%（圖1），hASH1在大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細胞癌中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P=0.42），hASH1在典型類癌和小細胞癌中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.1.4 神經(jīng)內(nèi)分泌標志物在肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達及與hASH1的關系 在36例類癌中，27例（75.0%）CgA陽性，26例（72.2%）Syn陽性，29例（80.6%）CD56陽性。在50例大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細胞癌中，24例（48.0%）CgA陽性，38例（76.0%）Syn陽性，42例（84.0%）CD56陽性（圖1）。統(tǒng)計分析顯示hASH1與CgA、Syn、CD56的表達均存在相關性（P＜0.05）（表1）。

2.2 Western blot檢測hASH1在肺鱗癌、腺癌和小細胞癌中蛋白的表達 在5例小細胞癌組織中均有hASH1基因的高表達，在9例鱗癌和9例腺癌組織中均無hASH1基因的表達（圖2）。

2.3 RT-PCR檢測hASH1在肺鱗癌、腺癌和小細胞癌中mRNA的表達 在5例小細胞癌組織中均有hASH1基因的表達，在9例鱗癌和9例腺癌組織中均物hASH1基因的表達（圖3）。

3 討論

hASH1基因編碼含有238個氨基酸的前體蛋白，該蛋白與MASH1（mouse achaete-scute homolog 1, MASH1）蛋白有95%的同源性，主要通過結合靶基因啟動子的E-box（核心序列為5′-CANNTG-3′）而啟動基因的轉錄，該過程還需要與其它bHLH蛋白形成二聚體才能與DNA有效的結合[1]。hASH1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、腎上腺嗜鉻細胞、甲狀腺C細胞、肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞等多種組織細胞的早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1,7,8]。

在鼠胚胎發(fā)育中敲除ASH1基因，會影響到神經(jīng)內(nèi)分泌分化，導致肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的缺失，而肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞又與肺小細胞癌的發(fā)生有關[9]。相反，在轉基因鼠中過表達ASH1能夠促進氣道上皮細胞的增生，ASH1與SV40（simian virus 40, SV40）大T抗原共同轉染能夠促進具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的肺腫瘤的形成[10]。最近，Osada等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在有ASH1表達的肺癌細胞系中以RNAi的方式抑制ASH1的表達能夠引起腫瘤細胞在G2-M期細胞周期停滯和細胞凋亡，其分子機制可能與半胱天冬酶-9和7的激活有關。人體活組織實時定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)hASH1在各種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤包括肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer, MTC）以及胎兒肺的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中都有表達，而在無神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的腫瘤和正常組織中卻未發(fā)現(xiàn)hASH1的表達[12]。這些均表明hASH1基因與具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化特征的腫瘤密切相關。

由于典型類癌、非典型類癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的發(fā)病率較低，我們未收集到這幾種肺癌的新鮮標本，肺小細胞癌在臨床上多采用非手術治療，本實驗也僅收集到5例新鮮標本，Western blot和RT-PCR的結果均顯示在這5例小細胞癌中均有hASH1基因的高表達，而在9例鱗癌和9例腺癌中均無hASH1基因的表達。免疫組化結果也顯示hASH1基因的表達僅限于具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的肺癌中，在正常肺組織、肺炎性假瘤、鱗癌、腺癌及大細胞癌中均未檢測到hASH1基因的表達，這說明hASH1基因對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤有高度特異性，可用于臨床病理診斷。而且在除典型類癌外的其它肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中，hASH1基因的表達陽性率均較高，提示hASH1基因對診斷肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌有較高的敏感性。另一方面，hASH1基因在典型類癌中表達較低（12.5%），而在非典型類癌和小細胞癌中的表達陽性率均很高（75%和77.5%），差異具有統(tǒng)計學意義。典型類癌具有較明顯和成熟的內(nèi)分泌表型，分化較高，一般無壞死，分裂像罕見，屬于低度惡性，其生物學行為近似良性腫瘤，預后較好，5年生存率達90%以上；非典型類癌分化較典型類癌差，癌巢中有壞死，核分裂像多見，屬于中度惡性，預后也較典型類癌差；小細胞癌是肺癌中分化最低、惡性程度最高的一種類型，生長迅速，轉移早，5年生存率僅1%-2%，這些均提示hASH1基因的表達與腫瘤的分化程度密切相關，分化程度越低hASH1基因的表達陽性率越高，但hASH1基因能否作為判斷患者預后的指標有待進一步的研究。

總之，hASH1基因對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤具有高度特異性和敏感性，有可能成為肺神經(jīng)分泌腫瘤尤其是肺小細胞癌的臨床病理診斷標志物，其與CgA、Syn、CD56聯(lián)合檢測，有望將肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的臨床病理診斷提高到一個新的水平。