Toppgene篩選肺腺癌候選疾病基因

王桂平 葉云 鄭文嶺 馬文麗

肺癌是我國男性和女性最主要致死性癌癥之一，包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma）屬于非小細(xì)胞肺癌，是最常見的肺癌之一，發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的20%-30%，在許多國家腺癌已超過鱗狀細(xì)胞癌。目前，人類對肺腺癌的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，其發(fā)生發(fā)展可能與體內(nèi)多種癌基因或抑癌基因的表達(dá)改變有關(guān)，如k-ras、p53、p16Ink4、HER2/Neu和COX-2等。因此，發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌致病基因，對于揭示肺腺癌發(fā)病機(jī)制及尋找新的藥物治療靶點(diǎn)有著重要意義。

目前，疾病基因發(fā)現(xiàn)的方法包括連鎖分析法、基因序列相似性、基因功能相似性及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)等多種途徑，其中以基于基因功能相似性方法在人類疾病候選基因發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用最廣泛[2-7]。近年來，許多基于功能相似性的生物信息學(xué)方法在人類疾病基因發(fā)現(xiàn)發(fā)揮重要作用，加速人類疾病基因發(fā)現(xiàn)過程，如POCUS、PROSPECTR、 SUSPECTS及Toppgene等，其中Toppgene具有高通量、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，特別是可對基因提供更全面的評價[2,7,8]。為發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌致病基因，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取肺腺癌數(shù)據(jù)集，并進(jìn)行差異基因分析，將獲取的差異基因作為“檢測基因集”；同時，采用genecard和Fable文獻(xiàn)挖掘已知肺腺癌疾病基因，并將其定義為“訓(xùn)練基因集”；最后，利用Toppgene篩選肺腺癌候選基因，并通過熒光定量PCR對其獲得的基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol RNA抽提試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix Ex TaTM熒光定量PCR試劑盒均由中山醫(yī)達(dá)安基因公司提供。3900臺式高通量DNA合成儀、 9700 PCR儀、7500全自動熒光定量PCR儀均為ABI產(chǎn)品。肺腺癌細(xì)胞株A549和人支氣管上皮細(xì)胞16HBE由廣州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，杭州四季青）、雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 獲取GEO數(shù)據(jù)集 首先，我們從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫（http:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載2個基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，即GSE7670和GSE10072。其中，GSE7670數(shù)據(jù)集來源于臺灣臺北榮民總醫(yī)院（Taipei veterans general hospital），采用GPL96芯片平臺（[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array），包括27個配對的正常肺組織與肺腺癌組織、2個混合組織、2個商業(yè)化的正常肺組織、1個正常肺上皮細(xì)胞株與7個商業(yè)化肺癌細(xì)胞株，共64個樣本；而另一個數(shù)據(jù)集GSE10072則來源于美國N.I.H遺傳流行病學(xué)部（Genetic Epidemiology Branch），也采用GPL96芯片平臺，疾病組織類型為肺腺癌，包括58個腺癌和49個正常肺組織，共107個樣本。

1.2.2 肺腺癌差異表達(dá)基因分析[9]基因差異表達(dá)分析采用dchip軟件分析包進(jìn)行dchip由哈佛大學(xué)生物統(tǒng)計系Cheng LI等聯(lián)合開發(fā)，是綜合性芯片分析軟件。該軟件運(yùn)行在于windows平臺，主要分析Affymetrix基因表達(dá)譜及SNP芯片數(shù)據(jù)，dchip可進(jìn)行差異基因識別、方差分析、主成分分析、時間序列分析、層次聚類、連鎖分析及SNP的拷貝數(shù)分析等。我們對GSE10072和GSE7670數(shù)據(jù)集中質(zhì)量合格芯片樣本分別采用dchip進(jìn)行差異基因分析，具體操作方法按dchip操作指南進(jìn)行（http://www.dchip.org），2-fold change的基因被選擇為差異表達(dá)基因。最后，采用交集方法獲得共同差異基因。

1.2.3 文獻(xiàn)挖掘方法挖掘已知肺腺癌疾病基因 Genecards（http://www.genecards.org/）是一個收集并展示人類基因及其產(chǎn)物和相關(guān)疾病等綜合信息的知識平臺。它是由以色列的Weizmann研究所基因組研究中心和生物信息學(xué)中心共同開發(fā)的，含有46 560個基因資料（2.38版），其中24 824個已經(jīng)被HUGO基因命名委員會審核通過。我們以“l(fā)ung adenocarcinoma”或“adenocarcinoma of lung”作為搜索詞，進(jìn)入Genecards搜索已知肺腺癌疾病基因[10]。同時，也采用Fable文獻(xiàn)挖掘工具搜索已知肺腺癌疾病基因，F(xiàn)able登陸方式：http://www.fable.chop.edu/。

1.2.4 Toppgene篩選新的肺腺癌疾病基因[11]Toppgene（http://toppgene.cchmc.org/）是個有效而方便的基于基因功能相似性的候選基因篩選方法。我們以Genecards搜索到的已知肺腺癌疾病基因作為“training gene set”，而以來自dchip所獲得的差異基因作為“test gene set”，然后按Toppgene操作方法獲得候選基因。

1.2.5 熒光定量RT-PCR（ΔΔCT法） 收集對數(shù)生長期A549或16HBE細(xì)胞，按文獻(xiàn)方法[12-14]分別進(jìn)行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積50 μL，由5×SYBR Green I PCR buffer（10 μL）、10 pmol/μL引物F或R（1 μL）、10 mM dNTPs（1 μL）、3 U/μL Taq酶（1 μL）、cDNA（5 μL）及ddH2O （31 μL）構(gòu)成， 以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件設(shè)定為：93oC、3 min，然后93oC、30 s，55oC、45 s，72oC、45 s，共40個循環(huán)。引物設(shè)計與合成利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，使上下游引物跨越1個內(nèi)含子，由中山大學(xué)達(dá)安基因公司合成。設(shè)計引物序列：CD36（擴(kuò)增片段長度104 bp）：5’-CAGATGCAGCCTCATTTCCA-3’（Forward Primer），5’-AACGTCGGATTCAAATACAGCA-3’（Reverse Primer）；PMAIP1（擴(kuò)增片段長度79 bp）：5’-GCTCCAGCAGAG CTGGAAGT-3’ （Forward Primer），5’-GAAGTTTCTG CCGGAAGTTCAG-3’（Reverse Primer）；FABP4（擴(kuò)增片段長度106 bp）：5’-GGCATGGCCAAACCTAACAT-3’（Forward Primer），5’-CCTGGCCCAGTATGAAGGAA A-3’（Reverse Primer）；β-actin（擴(kuò)增片段長度106 bp）（內(nèi)參基因）：5’-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’（Forward Primer），5’-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3’（Reverse Primer）。

1.2.6 熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用2-△△Ct進(jìn)行處理，其前提是目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相似[13]。計算各樣本平均CT值和△CT值（Ct=Ctsatb1-Ctβ-actin），計算2-△△Ct（Ct=Ct目的樣本-Ct參照樣本），其數(shù)值用于表示目的值相對于參照值的相對倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌差異表達(dá)基因 為了獲得肺腺癌共同差異表達(dá)基因，我們采用dchip分析軟件包分別對GSE10072和GSE7670數(shù)據(jù)集中合格芯片樣本進(jìn)行差異基因分析，最終獲得共同差異表達(dá)基因344個，其中上調(diào)基因94個，下調(diào)基因285個（表1）。

2.2 Genecards獲得已知肺腺癌疾病基因 以“l(fā)ung adenocarcinoma”或“adenocarcinoma of lung”作為搜索詞，進(jìn)入Genecards搜索已知肺腺癌疾病基因，共獲取230條gene card記錄；“l(fā)ung adenocarcinoma”作為搜索詞，通過Fable獲得118個基因與肺腺癌相關(guān)（過濾n＜10的基因）。對兩種方法獲得的疾病基因進(jìn)行交集分析，瀏覽每一條文獻(xiàn)，過濾不相關(guān)的基因，最終獲得277個已知肺腺癌疾病基因。

2.3 篩選新的肺腺癌疾病基因 采用Toppgene候選基因篩選方法，共獲得36個候選疾病基因，經(jīng)過文獻(xiàn)分析，15個基因已有在肺癌方面的報道（各基因報道文獻(xiàn)均不多），而另21個基因則在腫瘤方面的研究幾無報道（表2中加下劃線基因）。而對21個基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)有3個基因（CD36、COL1A1、COL3A1）與ECM-receptor interaction（hsa04512）有關(guān)，3個基因（CSF3、CXCL2、LEPR）與cytokine-cytokine receptor interaction（hsa04060）有關(guān)，而3個基因（EDN1、EDNRB、LEPR）與neuroactive ligand-receptor interaction（hsa04080）相關(guān)。

2.4 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 為了驗(yàn)證Toppgene所篩選的基因，我們挑選CD36、PMAIP1及FABP4三個基因，采用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，與對照組相比，CD36、PMAIP1及FABP4在A549細(xì)胞中均為下調(diào)表達(dá)，此與芯片數(shù)據(jù)一致（表3）。

3 討論

當(dāng)前，基因連鎖和基因表達(dá)譜分析等高通量基因組分析方法能有效地對基因進(jìn)行分類，并產(chǎn)生數(shù)百個候選疾病基因，但不能提供足夠的疾病特異性基因信息，因此，這些方法在疾病基因發(fā)現(xiàn)方面存在較大問題[15]。近年來，生物信息學(xué)方法廣泛應(yīng)用于疾病基因發(fā)現(xiàn)，特別是ToppGene在疾病基因發(fā)現(xiàn)方面具有獨(dú)特點(diǎn)。本研究中，我們的興趣在于通過計算生物學(xué)策略“ToppGene”，發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌疾病基因。通過本研究，我們篩選到36個候選疾病基因，經(jīng)過文獻(xiàn)分析，發(fā)現(xiàn)21個基因在腫瘤方面的研究幾無報道（Pubmed數(shù)庫范圍內(nèi)）。隨后，我們選取CD36、PMAIP1及FABP4三個基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD36、PMAIP1及FABP4在A549細(xì)胞中均下調(diào)表達(dá)，與芯片數(shù)據(jù)相一致。

表1 GSE7670和GSE10072中芯片樣本差異表達(dá)基因分析結(jié)果Tab 1 Analysis of lung adenocarcinoma differential expression genes against two GEO gene sets GSE10072 and GSE7670

表2 Toppgene篩選新的肺腺癌疾病候選基因（注：選取P＜0.01的基因）Tab 2 The screen of lung adenocarcinoma candidate genes using Toppgene(Note: Genes were selected based on P＜0.01)

表3 CD36、PMAIP1及FABP4的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Expression of three genes CD36, PMAIP1 and FABP4 using fluorescent quantitation PCR

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物信息量也成爆炸式增長，生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)作為成果展示和學(xué)術(shù)交流的主要方式之一，其數(shù)目之大、增長速度之快遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其它學(xué)科領(lǐng)域，例如，Medline收集了全世界4 800多種生物學(xué)及醫(yī)學(xué)雜志上的1 800多萬篇文獻(xiàn)，并且以每個月超過萬篇的速度增長。海量的文獻(xiàn)中蘊(yùn)涵著豐富的生物學(xué)信息，因此，如何挖掘和發(fā)現(xiàn)其中有生物學(xué)意義的信息具有重要意義。Genecards[10]是一種收載較為全面的基因數(shù)據(jù)平臺，對基因注釋全面而規(guī)范；Fable也是一種功能強(qiáng)大的文獻(xiàn)挖掘工具，特別是在人類疾病基因和蛋白的挖掘方面功能具有獨(dú)特優(yōu)勢。為了更全面地確定已知肺腺癌疾病基因， 在本研究中，我們聯(lián)合應(yīng)用Genecards和Fable兩種文獻(xiàn)挖掘工具，建立一個含277個基因的“訓(xùn)練基因集”，并應(yīng)用此“訓(xùn)練基因集”最終篩選到肺腺癌候選疾病基因。

Toppgene[11]是一種基于功能相似性的候選疾病基因篩選工具，Toppgene最大優(yōu)點(diǎn)在于，它可從GO注釋、通路、蛋白相互作用、疾病表型、疾病、轉(zhuǎn)錄因子等14個方面對候選基因進(jìn)行全面評估，最后依據(jù)總體P值對候選基因進(jìn)行排序。與其它基于功能相似性的候選基因發(fā)現(xiàn)方法一樣，基于Toppgene的候選疾病基因篩選方面也有一定的缺陷，如：①仍有約1/3的基因沒有作功能注釋；②僅有部分的基因具有通路和表型注釋；③蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)仍不完善，特別是通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)有限。相信，隨著生物信息學(xué)與各種生物技術(shù)的快速發(fā)展，Toppgene獲得的結(jié)果會越來越完善。

總之，通過本研究，我們篩選到一些可供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的肺腺癌候選基因，有關(guān)這此候選基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。