重組人纖維連接蛋白誘導的CIK細胞的生物學特性和對肺癌細胞株殺傷活性的體外研究

王士勇 杜微麗 張暉 烏蘭圖雅 張遠 何英 楊云鋒 劉颯 張哲 王佳玲

近年來，細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells, CIK）因其增殖速度快、溶瘤活性高、溶瘤譜廣及對多重耐藥腫瘤細胞敏感等優(yōu)點得到廣泛應用[1-4]。傳統(tǒng)培養(yǎng)CIK細胞方法需要較高的基礎細胞數(shù)，需用血細胞分離機分離外周血、提取單個核細胞，繁瑣耗時，污染機會大，特別不適宜異體供血。如何簡化培養(yǎng)過程，提高CIK細胞在體外增殖效率和細胞毒活性是基礎研究的一個熱點問題。重組人纖維連接蛋白（recombinant human fibronectin, RN）參與淋巴細胞的附著、伸展、分化和增殖[5]。本研究初步探討RN誘導法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法在促進CIK細胞體外增殖能力、提高主要效應細胞含量、增強細胞毒活性等方面的優(yōu)缺點，以期建立更加適合臨床應用的CIK細胞的培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 人肺癌細胞系及培養(yǎng) 肺癌細胞系A549（腺癌）、SPC-A1（腺癌）、CH27（鱗癌）和H460（大細胞癌）購于中國科學院上海細胞庫，常規(guī)細胞培養(yǎng)，選對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2 藥物、試劑及主要儀器 抗人CD3單克隆抗體購自美國BD Pharmigen公司；rhIFN-γ購自美國Pepro Techinc公司；rhIL-1購自美國Biosource公司；重組人IL-2為山東泉港藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；RN、無血清培養(yǎng)液KBM551、RPIM-1640培養(yǎng)液為日本寶生物公司產(chǎn)品；佛波酯、離子霉素、莫能霉素、破膜劑、溶血素、三色試劑盒CD8-FITC/CD4-PE/CD3-PC5及CD3-FITC/CD56-PE/CD16-PC5、細胞內細胞因子（IFN-γ、IL-4）測定試劑盒、FITC-抗穿孔素、PE-抗顆粒酶、APC-抗CD8熒光抗體均為美國BD公司產(chǎn)品。流式細胞儀為美國BD公司生產(chǎn)，型號FC 500 MPL。

1.3 CIK細胞的體外培養(yǎng)、擴增及存活率測定 抽取10例健康人（男、女各5例，年齡37歲-57歲）外周靜脈血每人50 mL，用淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞（PBMCs），每份血樣的PBMCs均分為2份，采用2種方法誘導培養(yǎng)，即RN誘導組和傳統(tǒng)方法組。RN誘導組采用新培養(yǎng)方法：即用RN（25 μg/mL）和抗CD3 mAb（5 μg/mL）提前24 h包被培養(yǎng)瓶，以后培養(yǎng)體系中只加入IL-2（1 000 U/mL）和KBM551無血清培養(yǎng)基。傳統(tǒng)方法組：提前24 h用抗CD3 mAb（5 μg/mL）包被培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)當天加入重組人IFN-γ（1 000 U/mL）、IL-1α（500 U/mL）、IL-2（1 000 U/mL），以后僅加入IL-2（1 000 U/mL）和KBM551無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件是在37oC、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每3天用臺盼藍染色檢測細胞存活率，記錄細胞絕對數(shù)。

1.4 淋巴細胞免疫表型檢測 分別取培養(yǎng)第0、7、14、21天樣品6 mL，離心后用PBS洗滌2遍，按照BD公司試劑盒說明書染色，采用流式細胞儀測定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+細胞的百分比。

1.5 CIK細胞體外殺瘤率測定 采用MTT法，選對數(shù)生長期的上述4種肺癌細胞株，調整細胞濃度為8×104/mL，于96孔板中每孔加入100 μL，37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取培養(yǎng)第15天的CIK細胞為效應細胞，按效:靶比20:1和40:1加入CIK細胞，設效應細胞殺傷組、效應細胞對照組、腫瘤細胞對照組，每組設6個復孔。共同培養(yǎng)48 h后加入2.5 mg/mL MTT溶液40 μL后再培養(yǎng)4 h。離心棄上清，加入150 μL DMSO溶液震蕩混勻，酶標儀選擇570 nm波長，測定各孔光密度值（optical density, OD），計算殺瘤率，計算公式為：殺瘤率（%）=1-[（殺傷組OD值-效應細胞對照組OD值）/腫瘤細胞對照組OD值]×100%。

1.6 細胞內細胞因子、穿孔素和顆粒酶檢測 取培養(yǎng)第15天的CIK細胞懸液0.5 mL，調整細胞數(shù)為1×106/mL，經(jīng)佛波酯、離子霉素激活、莫能霉素阻斷4 h，加入APC熒光標記的抗CD3 mAb，室溫、避光15 min標記細胞膜表面分子；而后加入破膜劑和抗IFN-γ、IL-4、穿孔素、顆粒酶B等熒光標記的單克隆抗體，室溫、避光30 min后，用PBS洗去多余的抗體，用流式細胞儀測定CD3+細胞中表達IFN-γ、IL-4、穿孔素、顆粒酶B的細胞的陽性率。

1.7 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學分析，試驗結果用Mean±SD表示，雙側t檢驗比較兩組均數(shù)的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法誘導CIK細胞的增殖活性與存活率 RN誘導組和傳統(tǒng)方法組的CIK細胞均表現(xiàn)出非常高的增殖活性（見圖1），從起始細胞數(shù)的（2.35±1.13）×107，至第22天達高峰，CIK細胞數(shù)分別達到（750.00±109.23）×107和（343.00±188.70）×107；而且，從培養(yǎng)第7天-第28天，RN法高出傳統(tǒng)法2倍-3.5倍，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。檢測RN誘導組和傳統(tǒng)方法組的CIK細胞存活率，第15天分別為（97.71±1.07）%和（95.48±2.01）%，第21天分別為（92.23±2.28）%和（90.85±5.28）%，存活率都在90%以上。

2.2 RN誘導CIK細胞免疫表型的變化 隨著體外培養(yǎng)天數(shù)的增加，RN誘導組和傳統(tǒng)方法組CD3+細胞比例均上調（見表1和圖2，傳統(tǒng)方法組流式結果圖未給出），至第21天，分別達到（97.08±2.14）%和（97.22±2.25）%，CD3+CD4+細胞比例分別下降至（15.31±8.49）%和（18.79±6.84）%，CD3+CD8+細胞比例分別上升到（76.26±8.60）%和（66.79±9.52）%；CD3+CD16+CD56+細胞比率也上升，由初始（1.83±0.212）%分別上升到（26.01±7.68）%和（31.32±7.34）%，且絕對數(shù)分別增加了3 778倍和2 069倍。與傳統(tǒng)方法組比較，RN組顯著增加了CD3+CD8+細胞的比率，在第14天增幅達高峰，為（77.30±6.72）%，顯著高于傳統(tǒng)方法組（68.31±8.87）%（P=0.02），直到第21天CD3+CD8+細胞仍然保持較高的比率，分別為（76.26±8.61）%和（66.79±9.52）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.042）；RN組對CD3+CD4+細胞比例的影響，與傳統(tǒng)方法組相比，第7、14、21天在數(shù)量上相似（P＞0.05）。另外，RN誘導組的CD3+CD16+CD56+細胞比例低于傳統(tǒng)方法組，經(jīng)統(tǒng)計學處理，第7、14、21天P值分別為0.389、0.439、0.153，均大于0.05。而且，由于RN誘導組第7天-第21天細胞總數(shù)明顯高于傳統(tǒng)方法組，故CD3+CD16+CD56+細胞絕對數(shù)較高。

2.3 CIK細胞體外殺瘤率的比較 RN誘導組和傳統(tǒng)方法組的CIK細胞，對4種肺癌細胞株體外殺瘤率比較，在同一效:靶比水平上無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。但將2種培養(yǎng)方法誘導的CIK細胞數(shù)量增加時，效:靶比40:1組的殺瘤率均明顯高于效靶比20:1組（P＜0.05），結果見表2。

2.4 RN組CIK細胞的細胞因子、穿孔素和顆粒酶B的檢測 RN誘導的第15天CIK細胞，分泌IFN-γ的細胞比例增加，從誘導前24.89%增加至58.76%；分泌IL-4的細胞比例變化不大，從誘導前2.16%下降到0.53%（圖3）；釋放顆粒酶B、穿孔素的細胞也呈陽性（圖4），誘導前為陰性。

圖1 2種培養(yǎng)方法誘導的CIK細胞的增殖能力Fig 1 Proliferation ability of CIK cells cultured by two methods RN: recombinant human fibronectin.

圖2 RN誘導法培養(yǎng)的CIK細胞中各亞群比例隨培養(yǎng)天數(shù)的變化Fig 2 The ratio changes of the CIK cells subsets cultured by RN

圖3 RN誘導前后分泌IFN-γ和IL-4細胞的陽性率Fig 3 The positive rate of cells secreting IFN-γ and IL-4 in CIK cells cultured by RN

圖4 RN誘導后的CIK細胞穿孔素、顆粒酶B的陽性率Fig 4 The positive rates of cells secreting perforin and granzyme B in CIK cells cultured by RN

表1 RN誘導法培養(yǎng)的CIK細胞中各亞群比例隨培養(yǎng)天數(shù)的變化Tab 1 The ratio changes of the CIK cells subsets cultured by RN

表2 兩種方法誘導的CIK細胞殺瘤率比較（%）Tab 2 The inhibition rate of CIK cells cultured by two methods (%)

3 討論

RN是重組人纖維連接蛋白片段，包括細胞結合域、肝磷脂結合域和CS1位點三個功能區(qū)域，由574個氨基酸組成，分子量為63 kDa。其生理活性為參與淋巴細胞的附著、伸展、分化和增殖。RN和抗CD3抗體可分別與T淋巴細胞上的VLA和TCR結合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，然后通過Ras途徑刺激T細胞的增殖和分化[5]。本實驗中新引入了RN，并首次系統(tǒng)地進行了生物學特性的研究，獲得了比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法更高的促淋巴細胞增殖效果，從細胞數(shù)量和質量上保證了CIK細胞回輸治療。新培養(yǎng)方法采用抽取50 mL外周靜脈血的方式代替血細胞分離機，減少了對供體免疫功能的影響和感染機會；以RN替代了IFN-γ和IL-1α，降低了總成本。

本研究結果顯示，健康人外周血淋巴細胞經(jīng)特定的細胞因子誘導及體外擴增培養(yǎng)后，CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+CD16+細胞比例較培養(yǎng)前明顯增加，CD3+CD4+及CD3+CD4+與CD3+CD8+的比值則明顯降低，即殺傷性T細胞比例增加，輔助性T細胞減少。CD8+T細胞是一群異質性的細胞，經(jīng)過刺激后“原始”CD8+T細胞能增殖、分化為效應性T細胞或記憶性T細胞。效應性T細胞可通過分泌穿孔素、顆粒酶等物質直接殺傷靶細胞，但其增殖能力弱，一旦機體內抗原的濃度減低或消退后效應性CD8+T細胞的數(shù)量急劇減少。記憶性CD8+T細胞經(jīng)初次抗原反應后能存活較長時間，若再次受到相同抗原刺激它能迅速地被活化并分泌大量的細胞因子。有研究[6-8]結果說明培養(yǎng)后CD8+T細胞是以記憶性細胞而不是以“原始”細胞為主，使得培養(yǎng)后的細胞具有一定的增殖潛能，更有利于機體的抗腫瘤反應。表面標記為CD3+CD56+CD16+的細胞被認為是CIK細胞的主要效應細胞，在體外擴增過程中可擴增至2 000倍以上。以往研究[9]表明CD3+CD56+CD16+細胞80%以上來源于CD8+殺傷性T細胞，理論上講伴隨CD3+CD8+細胞的增多，在回輸至患者體內后轉化為CIK細胞的比例也會增加。

體外細胞毒性試驗證實CIK細胞對多種肺癌細胞株都具有較強的殺傷力，其殺傷活性隨著效應細胞比例的增大而增加。RN誘導的CIK細胞與傳統(tǒng)方法獲得的CIK細胞對同一種瘤細胞的殺傷活性相當。

本研究初步探討了CIK細胞的殺瘤機理。健康人PBMCs經(jīng)體外RN誘導后的CIK細胞遇到抗原刺激很快被激活并分化為具有細胞毒性的效應細胞，分泌Th1型細胞因子IFN-γ，高表達TNF-α、Perforin等細胞壞死相關因子，幾乎不分泌Th2型細胞因子IL-4，因而在免疫應答中傾向于Th1優(yōu)勢。

RN誘導的CIK細胞與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，具有更強的體外增殖能力，增加了殺傷性T淋巴細胞的比例，并且可能帶來提高遠期殺瘤活性的優(yōu)勢。其體外殺瘤活性與傳統(tǒng)誘導方法作用相當。分泌殺傷性細胞因子、釋放顆粒酶、穿孔素的水平較激活前明顯增多。此外新培養(yǎng)方法所需血量少，對供體免疫功能影響小，使用無血清培養(yǎng)基減少了外源感染的機會；在我們的臨床應用研究中，RN誘導的CIK細胞單獨或與化療等其它治療方法聯(lián)合應用，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，抽血時間方便，不受病人的狀態(tài)和治療的影響，增加病人的抵抗力、體力，延長了病人的生存期[10]，值得推廣應用。